Introdução à Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Esta curta animação introduz o procedimento de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Este material foi desenvolvido por Yaw Adu-Sarkodie da Universidade de Ciências e Tecnologia Kwame Nkrumah e Cary Engleberg da Universidade de Michigan. E faz parte de um módulo de aprendizagem maior sobre métodos laboratoriais para microbiologia clínica. O módulo completo, a animação editável e o transcrito do vídeo estão disponíveis em http://open.umich.edu/education/med/oernetwork/med/microbiology/clinical-microbio-lab/2009. Copyright 2009-2010, Kwame Nkrumah University of Science and Technology and Cary Engleberg. Este material está sob licença Creative Commons Atribuição-Uso-Não-Comercial. Licença 3.0 http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/.

(Translated into Brazilian Portuguese by Marina S. Rodrigues)

A reação em cadeia da polimerase ou PCR pode direcionar e amplificar qualquer ácido nucleico específico de

amostras biológicas complexas.

O procedimento pode ser usado para diagnóstico, determinando se uma amostra clínica contém

uma sequência nuclear que é conhecida por ocorrer somente em um patógeno específico.

Ou os cientistas de laboratório podem usar a PCR para amplificar quantidades de um determinado

gene para investigação.

Para realizar a PCR, você já deve conhecer a sequência do ácido nucleico que deseja amplificar.

Em seguida, você define os limites da sequência-alvo identificando sequências curtas em

cada extremidade das fitas opostas.

Aqui, os limites da sequência-alvo são indicados por realce violeta e verde.

Se você mover nesta sequência no sentido 5' para 3', a direção

normal de síntese de DNA, o realce violeta se estende ao longo de uma fita e o realce verde

estende-se ao longo da fita complementar.

É difícil mostrar como a PCR funciona usando esta representação de dupla hélice do DNA então

o diagrama será convertido para uma imagem de mais fácil compreensão de escada do DNA.

Além da amostra clínica, a reação de PCR requer três ingredientes.

Em primeiro lugar, deve haver um enorme suprimento de cada um dos quatro nucleotídeos.

Segundo, o usuário deve adicionar uma grande oferta de pequenos primers sintéticos que são projetados

para hibridizar à sequência de ligação de ambas extremidades do DNA alvo.

Os primers são os ingredientes que tornam a reação específica, já que somente DNA que

situa-se entre estes dois primers será sintetizado na reação de PCR.

Em terceiro lugar, a reação requer uma enzima DNA polimerase.

Na PCR a polimerase é na verdade obtida de uma bactéria que normalmente cresce no mar ao redor

de fontes geotérmicas do fundo do oceano.

A bactéria é chamada Thermus Aquaticus e a polimerase é conhecida pela abreviação

Taq polimerase.

Esta enzima exótica é usada porque ela não é inativada pelas altas temperaturas geradas

na reação de PCR.

Todos esses elementos são misturados em proporções adequadas e colocados em um instrumento chamado

termociclador

Este instrumento pode ser programado para alterar a temperatura da mistura através de uma série

de ciclos repetitivos.

A temperatura da reação nesta demonstração é apresentada no painel inferior direito.

Na primeira rodada da PCR a temperatura é elevada a um ponto em que o DNA é desnaturado

e as fitas complementares separam-se uma da outra.

A temperatura é, em seguida, diminuída a um nível em que as fitas complementares podem se ligar novamente.

No entanto, uma vez que os primers estão presentes na mistura em grande quantidade, eles

tendem a se ligar aos sitios complementares quando as fitas se associam novamente.

Conforme a temperatura é abaixada ainda mais, a polimerase encontra as extremidades livres dos

primers e a enzima começa a adicionar nucleotídeos à extremidade do primer usando a fita

complementar como modelo

O mesmo processo ocorre quando o DNA se replica na divisão celular normal.

No final do primeiro round da PCR haverá duas cópias da sequência-alvo para cada

uma que estava presente na amostra clínica.

Você pode acompanhar a amplificação no painel que aparecerá no canto inferior esquerdo.

O mesmo processo é repetido na segunda rodada da PCR.

O termociclador aquece drasticamente a amostra para separar as fitas complementares do DNA,

incluindo aquelas que já foram sintetizadas.

A temperatura é abaixada para permitir que os primers se liguem aos seus sítios específicos e para iniciar

a síntese das fitas complementares pela Taq polimerase quando a temperatura é abaixada

novamente.

Na terceira rodada o mesmo ciclo de mudança de temperatura ocorre com a desnaturação das

fitas, vinculação dos primers quando a temperatura é abaixada e síntese de uma nova fita quando

as fitas são sinalizadas para a DNA-polimerase iniciar a adição de nucleotídeos.

No final do terceiro round existem oito cópias de fita dupla da sequência-alvo

onde originalmente havia apenas uma.

O quadro expandido no canto inferior esquerdo irá mostrar agora o que acontece com ciclos sucessivos

de PCR.

Em cada ciclo o número de cópias da sequência alvo dobra, assim haverá dezesseis

cópias após quatro ciclos, trinta e duas cópias, após cinco ciclos e sessenta e quatro cópias após

seis ciclos.

Quando o termociclador completar quarenta ciclos os primers e os nucleotídeos estarão

provavelmente exauridos, mas teoricamente haverá 10 elevado a 12 cópias.

A seqüência-alvo terá sido amplificada um trilhão de vezes.

Este nível de amplificação produz uma quantidade de DNA específico que agora pode ser visualizado

por eletroforese em gel.

A grande mancha de DNA no topo do gel representa o DNA complexo que estava presente

na amostra clínica.

No entanto, uma nova banda menor aparece em amostras colhidas nos ciclos posteriores da PCR.

Para diagnóstico laboratorial o DNA amplificado pode ser detectado e quantificado por

métodos mais simples e eficientes do que a eletroforese em gel.

Um desses métodos é discutido em um próximo programa.