(Translated into Brazilian Portuguese by Marina S. Rodrigues)
A reação em cadeia da polimerase ou PCR pode direcionar e amplificar qualquer ácido nucleico específico de
amostras biológicas complexas.
O procedimento pode ser usado para diagnóstico, determinando se uma amostra clínica contém
uma sequência nuclear que é conhecida por ocorrer somente em um patógeno específico.
Ou os cientistas de laboratório podem usar a PCR para amplificar quantidades de um determinado
gene para investigação.
Para realizar a PCR, você já deve conhecer a sequência do ácido nucleico que deseja amplificar.
Em seguida, você define os limites da sequência-alvo identificando sequências curtas em
cada extremidade das fitas opostas.
Aqui, os limites da sequência-alvo são indicados por realce violeta e verde.
Se você mover nesta sequência no sentido 5' para 3', a direção
normal de síntese de DNA, o realce violeta se estende ao longo de uma fita e o realce verde
estende-se ao longo da fita complementar.
É difícil mostrar como a PCR funciona usando esta representação de dupla hélice do DNA então
o diagrama será convertido para uma imagem de mais fácil compreensão de escada do DNA.
Além da amostra clínica, a reação de PCR requer três ingredientes.
Em primeiro lugar, deve haver um enorme suprimento de cada um dos quatro nucleotídeos.
Segundo, o usuário deve adicionar uma grande oferta de pequenos primers sintéticos que são projetados
para hibridizar à sequência de ligação de ambas extremidades do DNA alvo.
Os primers são os ingredientes que tornam a reação específica, já que somente DNA que
situa-se entre estes dois primers será sintetizado na reação de PCR.
Em terceiro lugar, a reação requer uma enzima DNA polimerase.
Na PCR a polimerase é na verdade obtida de uma bactéria que normalmente cresce no mar ao redor
de fontes geotérmicas do fundo do oceano.
A bactéria é chamada Thermus Aquaticus e a polimerase é conhecida pela abreviação
Taq polimerase.
Esta enzima exótica é usada porque ela não é inativada pelas altas temperaturas geradas
na reação de PCR.
Todos esses elementos são misturados em proporções adequadas e colocados em um instrumento chamado
termociclador
Este instrumento pode ser programado para alterar a temperatura da mistura através de uma série
de ciclos repetitivos.
A temperatura da reação nesta demonstração é apresentada no painel inferior direito.
Na primeira rodada da PCR a temperatura é elevada a um ponto em que o DNA é desnaturado
e as fitas complementares separam-se uma da outra.
A temperatura é, em seguida, diminuída a um nível em que as fitas complementares podem se ligar novamente.
No entanto, uma vez que os primers estão presentes na mistura em grande quantidade, eles
tendem a se ligar aos sitios complementares quando as fitas se associam novamente.
Conforme a temperatura é abaixada ainda mais, a polimerase encontra as extremidades livres dos
primers e a enzima começa a adicionar nucleotídeos à extremidade do primer usando a fita
complementar como modelo
O mesmo processo ocorre quando o DNA se replica na divisão celular normal.
No final do primeiro round da PCR haverá duas cópias da sequência-alvo para cada
uma que estava presente na amostra clínica.
Você pode acompanhar a amplificação no painel que aparecerá no canto inferior esquerdo.
O mesmo processo é repetido na segunda rodada da PCR.
O termociclador aquece drasticamente a amostra para separar as fitas complementares do DNA,
incluindo aquelas que já foram sintetizadas.
A temperatura é abaixada para permitir que os primers se liguem aos seus sítios específicos e para iniciar
a síntese das fitas complementares pela Taq polimerase quando a temperatura é abaixada
novamente.
Na terceira rodada o mesmo ciclo de mudança de temperatura ocorre com a desnaturação das
fitas, vinculação dos primers quando a temperatura é abaixada e síntese de uma nova fita quando
as fitas são sinalizadas para a DNA-polimerase iniciar a adição de nucleotídeos.
No final do terceiro round existem oito cópias de fita dupla da sequência-alvo
onde originalmente havia apenas uma.
O quadro expandido no canto inferior esquerdo irá mostrar agora o que acontece com ciclos sucessivos
de PCR.
Em cada ciclo o número de cópias da sequência alvo dobra, assim haverá dezesseis
cópias após quatro ciclos, trinta e duas cópias, após cinco ciclos e sessenta e quatro cópias após
seis ciclos.
Quando o termociclador completar quarenta ciclos os primers e os nucleotídeos estarão
provavelmente exauridos, mas teoricamente haverá 10 elevado a 12 cópias.
A seqüência-alvo terá sido amplificada um trilhão de vezes.
Este nível de amplificação produz uma quantidade de DNA específico que agora pode ser visualizado
por eletroforese em gel.
A grande mancha de DNA no topo do gel representa o DNA complexo que estava presente
na amostra clínica.
No entanto, uma nova banda menor aparece em amostras colhidas nos ciclos posteriores da PCR.
Para diagnóstico laboratorial o DNA amplificado pode ser detectado e quantificado por
métodos mais simples e eficientes do que a eletroforese em gel.
Um desses métodos é discutido em um próximo programa.