(Translated into Brazilian Portuguese by Marina S. Rodrigues) A reação em cadeia da polimerase ou PCR pode direcionar e amplificar qualquer ácido nucleico específico de amostras biológicas complexas. O procedimento pode ser usado para diagnóstico, determinando se uma amostra clínica contém uma sequência nuclear que é conhecida por ocorrer somente em um patógeno específico. Ou os cientistas de laboratório podem usar a PCR para amplificar quantidades de um determinado gene para investigação. Para realizar a PCR, você já deve conhecer a sequência do ácido nucleico que deseja amplificar. Em seguida, você define os limites da sequência-alvo identificando sequências curtas em cada extremidade das fitas opostas. Aqui, os limites da sequência-alvo são indicados por realce violeta e verde. Se você mover nesta sequência no sentido 5' para 3', a direção normal de síntese de DNA, o realce violeta se estende ao longo de uma fita e o realce verde estende-se ao longo da fita complementar. É difícil mostrar como a PCR funciona usando esta representação de dupla hélice do DNA então o diagrama será convertido para uma imagem de mais fácil compreensão de escada do DNA. Além da amostra clínica, a reação de PCR requer três ingredientes. Em primeiro lugar, deve haver um enorme suprimento de cada um dos quatro nucleotídeos. Segundo, o usuário deve adicionar uma grande oferta de pequenos primers sintéticos que são projetados para hibridizar à sequência de ligação de ambas extremidades do DNA alvo. Os primers são os ingredientes que tornam a reação específica, já que somente DNA que situa-se entre estes dois primers será sintetizado na reação de PCR. Em terceiro lugar, a reação requer uma enzima DNA polimerase. Na PCR a polimerase é na verdade obtida de uma bactéria que normalmente cresce no mar ao redor de fontes geotérmicas do fundo do oceano. A bactéria é chamada Thermus Aquaticus e a polimerase é conhecida pela abreviação Taq polimerase. Esta enzima exótica é usada porque ela não é inativada pelas altas temperaturas geradas na reação de PCR. Todos esses elementos são misturados em proporções adequadas e colocados em um instrumento chamado termociclador Este instrumento pode ser programado para alterar a temperatura da mistura através de uma série de ciclos repetitivos. A temperatura da reação nesta demonstração é apresentada no painel inferior direito. Na primeira rodada da PCR a temperatura é elevada a um ponto em que o DNA é desnaturado e as fitas complementares separam-se uma da outra. A temperatura é, em seguida, diminuída a um nível em que as fitas complementares podem se ligar novamente. No entanto, uma vez que os primers estão presentes na mistura em grande quantidade, eles tendem a se ligar aos sitios complementares quando as fitas se associam novamente. Conforme a temperatura é abaixada ainda mais, a polimerase encontra as extremidades livres dos primers e a enzima começa a adicionar nucleotídeos à extremidade do primer usando a fita complementar como modelo O mesmo processo ocorre quando o DNA se replica na divisão celular normal. No final do primeiro round da PCR haverá duas cópias da sequência-alvo para cada uma que estava presente na amostra clínica. Você pode acompanhar a amplificação no painel que aparecerá no canto inferior esquerdo. O mesmo processo é repetido na segunda rodada da PCR. O termociclador aquece drasticamente a amostra para separar as fitas complementares do DNA, incluindo aquelas que já foram sintetizadas. A temperatura é abaixada para permitir que os primers se liguem aos seus sítios específicos e para iniciar a síntese das fitas complementares pela Taq polimerase quando a temperatura é abaixada novamente. Na terceira rodada o mesmo ciclo de mudança de temperatura ocorre com a desnaturação das fitas, vinculação dos primers quando a temperatura é abaixada e síntese de uma nova fita quando as fitas são sinalizadas para a DNA-polimerase iniciar a adição de nucleotídeos. No final do terceiro round existem oito cópias de fita dupla da sequência-alvo onde originalmente havia apenas uma. O quadro expandido no canto inferior esquerdo irá mostrar agora o que acontece com ciclos sucessivos de PCR. Em cada ciclo o número de cópias da sequência alvo dobra, assim haverá dezesseis cópias após quatro ciclos, trinta e duas cópias, após cinco ciclos e sessenta e quatro cópias após seis ciclos. Quando o termociclador completar quarenta ciclos os primers e os nucleotídeos estarão provavelmente exauridos, mas teoricamente haverá 10 elevado a 12 cópias. A seqüência-alvo terá sido amplificada um trilhão de vezes. Este nível de amplificação produz uma quantidade de DNA específico que agora pode ser visualizado por eletroforese em gel. A grande mancha de DNA no topo do gel representa o DNA complexo que estava presente na amostra clínica. No entanto, uma nova banda menor aparece em amostras colhidas nos ciclos posteriores da PCR. Para diagnóstico laboratorial o DNA amplificado pode ser detectado e quantificado por métodos mais simples e eficientes do que a eletroforese em gel. Um desses métodos é discutido em um próximo programa.