1 00:00:00,000 --> 00:00:02,000 (Translated into Brazilian Portuguese by Marina S. Rodrigues) 2 00:00:02,000 --> 00:00:10,000 A reação em cadeia da polimerase ou PCR pode direcionar e amplificar qualquer ácido nucleico específico de 3 00:00:10,000 --> 00:00:13,000 amostras biológicas complexas. 4 00:00:13,000 --> 00:00:18,000 O procedimento pode ser usado para diagnóstico, determinando se uma amostra clínica contém 5 00:00:18,000 --> 00:00:23,000 uma sequência nuclear que é conhecida por ocorrer somente em um patógeno específico. 6 00:00:23,000 --> 00:00:31,000 Ou os cientistas de laboratório podem usar a PCR para amplificar quantidades de um determinado 7 00:00:31,000 --> 00:00:34,000 gene para investigação. 8 00:00:34,000 --> 00:00:39,000 Para realizar a PCR, você já deve conhecer a sequência do ácido nucleico que deseja amplificar. 9 00:00:39,000 --> 00:00:45,000 Em seguida, você define os limites da sequência-alvo identificando sequências curtas em 10 00:00:45,000 --> 00:00:48,000 cada extremidade das fitas opostas. 11 00:00:48,000 --> 00:00:54,000 Aqui, os limites da sequência-alvo são indicados por realce violeta e verde. 12 00:00:54,000 --> 00:01:00,000 Se você mover nesta sequência no sentido 5' para 3', a direção 13 00:01:00,000 --> 00:01:06,000 normal de síntese de DNA, o realce violeta se estende ao longo de uma fita e o realce verde 14 00:01:06,000 --> 00:01:09,000 estende-se ao longo da fita complementar. 15 00:01:09,000 --> 00:01:15,000 É difícil mostrar como a PCR funciona usando esta representação de dupla hélice do DNA então 16 00:01:15,000 --> 00:01:22,000 o diagrama será convertido para uma imagem de mais fácil compreensão de escada do DNA. 17 00:01:22,000 --> 00:01:27,000 Além da amostra clínica, a reação de PCR requer três ingredientes. 18 00:01:27,000 --> 00:01:33,000 Em primeiro lugar, deve haver um enorme suprimento de cada um dos quatro nucleotídeos. 19 00:01:33,000 --> 00:01:40,000 Segundo, o usuário deve adicionar uma grande oferta de pequenos primers sintéticos que são projetados 20 00:01:40,000 --> 00:01:47,000 para hibridizar à sequência de ligação de ambas extremidades do DNA alvo. 21 00:01:47,000 --> 00:01:53,000 Os primers são os ingredientes que tornam a reação específica, já que somente DNA que 22 00:01:53,000 --> 00:01:58,000 situa-se entre estes dois primers será sintetizado na reação de PCR. 23 00:01:58,000 --> 00:02:04,000 Em terceiro lugar, a reação requer uma enzima DNA polimerase. 24 00:02:04,000 --> 00:02:10,000 Na PCR a polimerase é na verdade obtida de uma bactéria que normalmente cresce no mar ao redor 25 00:02:10,000 --> 00:02:14,000 de fontes geotérmicas do fundo do oceano. 26 00:02:14,000 --> 00:02:20,000 A bactéria é chamada Thermus Aquaticus e a polimerase é conhecida pela abreviação 27 00:02:20,000 --> 00:02:21,000 Taq polimerase. 28 00:02:21,000 --> 00:02:29,000 Esta enzima exótica é usada porque ela não é inativada pelas altas temperaturas geradas 29 00:02:29,000 --> 00:02:31,000 na reação de PCR. 30 00:02:31,000 --> 00:02:38,000 Todos esses elementos são misturados em proporções adequadas e colocados em um instrumento chamado 31 00:02:38,000 --> 00:02:40,000 termociclador 32 00:02:40,000 --> 00:02:47,000 Este instrumento pode ser programado para alterar a temperatura da mistura através de uma série 33 00:02:47,000 --> 00:02:49,000 de ciclos repetitivos. 34 00:02:49,000 --> 00:02:57,000 A temperatura da reação nesta demonstração é apresentada no painel inferior direito. 35 00:02:57,000 --> 00:03:04,000 Na primeira rodada da PCR a temperatura é elevada a um ponto em que o DNA é desnaturado 36 00:03:04,000 --> 00:03:08,000 e as fitas complementares separam-se uma da outra. 37 00:03:08,000 --> 00:03:14,000 A temperatura é, em seguida, diminuída a um nível em que as fitas complementares podem se ligar novamente. 38 00:03:14,000 --> 00:03:24,000 No entanto, uma vez que os primers estão presentes na mistura em grande quantidade, eles 39 00:03:24,000 --> 00:03:28,000 tendem a se ligar aos sitios complementares quando as fitas se associam novamente. 40 00:03:28,000 --> 00:03:37,000 Conforme a temperatura é abaixada ainda mais, a polimerase encontra as extremidades livres dos 41 00:03:37,000 --> 00:03:44,000 primers e a enzima começa a adicionar nucleotídeos à extremidade do primer usando a fita 42 00:03:44,000 --> 00:03:45,000 complementar como modelo 43 00:03:45,000 --> 00:03:52,000 O mesmo processo ocorre quando o DNA se replica na divisão celular normal. 44 00:03:52,000 --> 00:04:00,000 No final do primeiro round da PCR haverá duas cópias da sequência-alvo para cada 45 00:04:00,000 --> 00:04:04,000 uma que estava presente na amostra clínica. 46 00:04:04,000 --> 00:04:12,000 Você pode acompanhar a amplificação no painel que aparecerá no canto inferior esquerdo. 47 00:04:12,000 --> 00:04:17,000 O mesmo processo é repetido na segunda rodada da PCR. 48 00:04:17,000 --> 00:04:25,000 O termociclador aquece drasticamente a amostra para separar as fitas complementares do DNA, 49 00:04:25,000 --> 00:04:28,000 incluindo aquelas que já foram sintetizadas. 50 00:04:28,000 --> 00:04:35,000 A temperatura é abaixada para permitir que os primers se liguem aos seus sítios específicos e para iniciar 51 00:04:35,000 --> 00:04:41,000 a síntese das fitas complementares pela Taq polimerase quando a temperatura é abaixada 52 00:04:41,000 --> 00:04:47,000 novamente. 53 00:04:47,000 --> 00:04:54,000 Na terceira rodada o mesmo ciclo de mudança de temperatura ocorre com a desnaturação das 54 00:04:54,000 --> 00:05:00,000 fitas, vinculação dos primers quando a temperatura é abaixada e síntese de uma nova fita quando 55 00:05:00,000 --> 00:05:06,000 as fitas são sinalizadas para a DNA-polimerase iniciar a adição de nucleotídeos. 56 00:05:06,000 --> 00:05:14,000 No final do terceiro round existem oito cópias de fita dupla da sequência-alvo 57 00:05:14,000 --> 00:05:18,000 onde originalmente havia apenas uma. 58 00:05:18,000 --> 00:05:25,000 O quadro expandido no canto inferior esquerdo irá mostrar agora o que acontece com ciclos sucessivos 59 00:05:25,000 --> 00:05:28,000 de PCR. 60 00:05:28,000 --> 00:05:34,000 Em cada ciclo o número de cópias da sequência alvo dobra, assim haverá dezesseis 61 00:05:34,000 --> 00:05:42,000 cópias após quatro ciclos, trinta e duas cópias, após cinco ciclos e sessenta e quatro cópias após 62 00:05:42,000 --> 00:05:44,000 seis ciclos. 63 00:05:44,000 --> 00:05:50,000 Quando o termociclador completar quarenta ciclos os primers e os nucleotídeos estarão 64 00:05:50,000 --> 00:05:57,000 provavelmente exauridos, mas teoricamente haverá 10 elevado a 12 cópias. 65 00:05:57,000 --> 00:06:03,000 A seqüência-alvo terá sido amplificada um trilhão de vezes. 66 00:06:03,000 --> 00:06:11,000 Este nível de amplificação produz uma quantidade de DNA específico que agora pode ser visualizado 67 00:06:11,000 --> 00:06:14,000 por eletroforese em gel. 68 00:06:14,000 --> 00:06:22,000 A grande mancha de DNA no topo do gel representa o DNA complexo que estava presente 69 00:06:22,000 --> 00:06:24,000 na amostra clínica. 70 00:06:24,000 --> 00:06:34,000 No entanto, uma nova banda menor aparece em amostras colhidas nos ciclos posteriores da PCR. 71 00:06:34,000 --> 00:06:43,000 Para diagnóstico laboratorial o DNA amplificado pode ser detectado e quantificado por 72 00:06:43,000 --> 00:06:49,000 métodos mais simples e eficientes do que a eletroforese em gel. 73 00:06:49,000 --> 00:06:53,000 Um desses métodos é discutido em um próximo programa.