WEBVTT 00:00:00.000 --> 00:00:02.000 (Translated into Brazilian Portuguese by Marina S. Rodrigues) 00:00:02.000 --> 00:00:10.000 A reação em cadeia da polimerase ou PCR pode direcionar e amplificar qualquer ácido nucleico específico de 00:00:10.000 --> 00:00:13.000 amostras biológicas complexas. 00:00:13.000 --> 00:00:18.000 O procedimento pode ser usado para diagnóstico, determinando se uma amostra clínica contém 00:00:18.000 --> 00:00:23.000 uma sequência nuclear que é conhecida por ocorrer somente em um patógeno específico. 00:00:23.000 --> 00:00:31.000 Ou os cientistas de laboratório podem usar a PCR para amplificar quantidades de um determinado 00:00:31.000 --> 00:00:34.000 gene para investigação. 00:00:34.000 --> 00:00:39.000 Para realizar a PCR, você já deve conhecer a sequência do ácido nucleico que deseja amplificar. 00:00:39.000 --> 00:00:45.000 Em seguida, você define os limites da sequência-alvo identificando sequências curtas em 00:00:45.000 --> 00:00:48.000 cada extremidade das fitas opostas. 00:00:48.000 --> 00:00:54.000 Aqui, os limites da sequência-alvo são indicados por realce violeta e verde. 00:00:54.000 --> 00:01:00.000 Se você mover nesta sequência no sentido 5' para 3', a direção 00:01:00.000 --> 00:01:06.000 normal de síntese de DNA, o realce violeta se estende ao longo de uma fita e o realce verde 00:01:06.000 --> 00:01:09.000 estende-se ao longo da fita complementar. 00:01:09.000 --> 00:01:15.000 É difícil mostrar como a PCR funciona usando esta representação de dupla hélice do DNA então 00:01:15.000 --> 00:01:22.000 o diagrama será convertido para uma imagem de mais fácil compreensão de escada do DNA. 00:01:22.000 --> 00:01:27.000 Além da amostra clínica, a reação de PCR requer três ingredientes. 00:01:27.000 --> 00:01:33.000 Em primeiro lugar, deve haver um enorme suprimento de cada um dos quatro nucleotídeos. 00:01:33.000 --> 00:01:40.000 Segundo, o usuário deve adicionar uma grande oferta de pequenos primers sintéticos que são projetados 00:01:40.000 --> 00:01:47.000 para hibridizar à sequência de ligação de ambas extremidades do DNA alvo. 00:01:47.000 --> 00:01:53.000 Os primers são os ingredientes que tornam a reação específica, já que somente DNA que 00:01:53.000 --> 00:01:58.000 situa-se entre estes dois primers será sintetizado na reação de PCR. 00:01:58.000 --> 00:02:04.000 Em terceiro lugar, a reação requer uma enzima DNA polimerase. 00:02:04.000 --> 00:02:10.000 Na PCR a polimerase é na verdade obtida de uma bactéria que normalmente cresce no mar ao redor 00:02:10.000 --> 00:02:14.000 de fontes geotérmicas do fundo do oceano. 00:02:14.000 --> 00:02:20.000 A bactéria é chamada Thermus Aquaticus e a polimerase é conhecida pela abreviação 00:02:20.000 --> 00:02:21.000 Taq polimerase. 00:02:21.000 --> 00:02:29.000 Esta enzima exótica é usada porque ela não é inativada pelas altas temperaturas geradas 00:02:29.000 --> 00:02:31.000 na reação de PCR. 00:02:31.000 --> 00:02:38.000 Todos esses elementos são misturados em proporções adequadas e colocados em um instrumento chamado 00:02:38.000 --> 00:02:40.000 termociclador 00:02:40.000 --> 00:02:47.000 Este instrumento pode ser programado para alterar a temperatura da mistura através de uma série 00:02:47.000 --> 00:02:49.000 de ciclos repetitivos. 00:02:49.000 --> 00:02:57.000 A temperatura da reação nesta demonstração é apresentada no painel inferior direito. 00:02:57.000 --> 00:03:04.000 Na primeira rodada da PCR a temperatura é elevada a um ponto em que o DNA é desnaturado 00:03:04.000 --> 00:03:08.000 e as fitas complementares separam-se uma da outra. 00:03:08.000 --> 00:03:14.000 A temperatura é, em seguida, diminuída a um nível em que as fitas complementares podem se ligar novamente. 00:03:14.000 --> 00:03:24.000 No entanto, uma vez que os primers estão presentes na mistura em grande quantidade, eles 00:03:24.000 --> 00:03:28.000 tendem a se ligar aos sitios complementares quando as fitas se associam novamente. 00:03:28.000 --> 00:03:37.000 Conforme a temperatura é abaixada ainda mais, a polimerase encontra as extremidades livres dos 00:03:37.000 --> 00:03:44.000 primers e a enzima começa a adicionar nucleotídeos à extremidade do primer usando a fita 00:03:44.000 --> 00:03:45.000 complementar como modelo 00:03:45.000 --> 00:03:52.000 O mesmo processo ocorre quando o DNA se replica na divisão celular normal. 00:03:52.000 --> 00:04:00.000 No final do primeiro round da PCR haverá duas cópias da sequência-alvo para cada 00:04:00.000 --> 00:04:04.000 uma que estava presente na amostra clínica. 00:04:04.000 --> 00:04:12.000 Você pode acompanhar a amplificação no painel que aparecerá no canto inferior esquerdo. 00:04:12.000 --> 00:04:17.000 O mesmo processo é repetido na segunda rodada da PCR. 00:04:17.000 --> 00:04:25.000 O termociclador aquece drasticamente a amostra para separar as fitas complementares do DNA, 00:04:25.000 --> 00:04:28.000 incluindo aquelas que já foram sintetizadas. 00:04:28.000 --> 00:04:35.000 A temperatura é abaixada para permitir que os primers se liguem aos seus sítios específicos e para iniciar 00:04:35.000 --> 00:04:41.000 a síntese das fitas complementares pela Taq polimerase quando a temperatura é abaixada 00:04:41.000 --> 00:04:47.000 novamente. 00:04:47.000 --> 00:04:54.000 Na terceira rodada o mesmo ciclo de mudança de temperatura ocorre com a desnaturação das 00:04:54.000 --> 00:05:00.000 fitas, vinculação dos primers quando a temperatura é abaixada e síntese de uma nova fita quando 00:05:00.000 --> 00:05:06.000 as fitas são sinalizadas para a DNA-polimerase iniciar a adição de nucleotídeos. 00:05:06.000 --> 00:05:14.000 No final do terceiro round existem oito cópias de fita dupla da sequência-alvo 00:05:14.000 --> 00:05:18.000 onde originalmente havia apenas uma. 00:05:18.000 --> 00:05:25.000 O quadro expandido no canto inferior esquerdo irá mostrar agora o que acontece com ciclos sucessivos 00:05:25.000 --> 00:05:28.000 de PCR. 00:05:28.000 --> 00:05:34.000 Em cada ciclo o número de cópias da sequência alvo dobra, assim haverá dezesseis 00:05:34.000 --> 00:05:42.000 cópias após quatro ciclos, trinta e duas cópias, após cinco ciclos e sessenta e quatro cópias após 00:05:42.000 --> 00:05:44.000 seis ciclos. 00:05:44.000 --> 00:05:50.000 Quando o termociclador completar quarenta ciclos os primers e os nucleotídeos estarão 00:05:50.000 --> 00:05:57.000 provavelmente exauridos, mas teoricamente haverá 10 elevado a 12 cópias. 00:05:57.000 --> 00:06:03.000 A seqüência-alvo terá sido amplificada um trilhão de vezes. 00:06:03.000 --> 00:06:11.000 Este nível de amplificação produz uma quantidade de DNA específico que agora pode ser visualizado 00:06:11.000 --> 00:06:14.000 por eletroforese em gel. 00:06:14.000 --> 00:06:22.000 A grande mancha de DNA no topo do gel representa o DNA complexo que estava presente 00:06:22.000 --> 00:06:24.000 na amostra clínica. 00:06:24.000 --> 00:06:34.000 No entanto, uma nova banda menor aparece em amostras colhidas nos ciclos posteriores da PCR. 00:06:34.000 --> 00:06:43.000 Para diagnóstico laboratorial o DNA amplificado pode ser detectado e quantificado por 00:06:43.000 --> 00:06:49.000 métodos mais simples e eficientes do que a eletroforese em gel. 00:06:49.000 --> 00:06:53.000 Um desses métodos é discutido em um próximo programa.