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Format: Layer, Start, End, Style, Name, MarginL, MarginR, MarginV, Effect, Text
Dialogue: 0,0:00:00.00,0:00:02.00,Default,,0000,0000,0000,,(Translated into Brazilian Portuguese by Marina S. Rodrigues)
Dialogue: 0,0:00:02.00,0:00:10.00,Default,,0000,0000,0000,,A reação em cadeia da polimerase ou PCR pode direcionar e amplificar qualquer ácido nucleico específico de
Dialogue: 0,0:00:10.00,0:00:13.00,Default,,0000,0000,0000,,amostras biológicas complexas.
Dialogue: 0,0:00:13.00,0:00:18.00,Default,,0000,0000,0000,,O procedimento pode ser usado para diagnóstico, determinando se uma amostra clínica contém
Dialogue: 0,0:00:18.00,0:00:23.00,Default,,0000,0000,0000,,uma sequência nuclear que é conhecida por ocorrer somente em um patógeno específico.
Dialogue: 0,0:00:23.00,0:00:31.00,Default,,0000,0000,0000,,Ou os cientistas de laboratório podem usar a PCR para amplificar quantidades de um determinado
Dialogue: 0,0:00:31.00,0:00:34.00,Default,,0000,0000,0000,,gene para investigação.
Dialogue: 0,0:00:34.00,0:00:39.00,Default,,0000,0000,0000,,Para realizar a PCR, você já deve conhecer a sequência do ácido nucleico que deseja amplificar.
Dialogue: 0,0:00:39.00,0:00:45.00,Default,,0000,0000,0000,,Em seguida, você define os limites da sequência-alvo identificando sequências curtas em
Dialogue: 0,0:00:45.00,0:00:48.00,Default,,0000,0000,0000,,cada extremidade das fitas opostas.
Dialogue: 0,0:00:48.00,0:00:54.00,Default,,0000,0000,0000,,Aqui, os limites da sequência-alvo são indicados por realce violeta e verde.
Dialogue: 0,0:00:54.00,0:01:00.00,Default,,0000,0000,0000,,Se você mover nesta sequência no sentido 5' para 3', a direção
Dialogue: 0,0:01:00.00,0:01:06.00,Default,,0000,0000,0000,,normal de síntese de DNA, o realce violeta se estende ao longo de uma fita e o realce verde
Dialogue: 0,0:01:06.00,0:01:09.00,Default,,0000,0000,0000,,estende-se ao longo da fita complementar.
Dialogue: 0,0:01:09.00,0:01:15.00,Default,,0000,0000,0000,,É difícil mostrar como a PCR funciona usando esta representação de dupla hélice do DNA então
Dialogue: 0,0:01:15.00,0:01:22.00,Default,,0000,0000,0000,,o diagrama será convertido para uma imagem de mais fácil compreensão de escada do DNA.
Dialogue: 0,0:01:22.00,0:01:27.00,Default,,0000,0000,0000,,Além da amostra clínica, a reação de PCR requer três ingredientes.
Dialogue: 0,0:01:27.00,0:01:33.00,Default,,0000,0000,0000,,Em primeiro lugar, deve haver um enorme suprimento de cada um dos quatro nucleotídeos.
Dialogue: 0,0:01:33.00,0:01:40.00,Default,,0000,0000,0000,,Segundo, o usuário deve adicionar uma grande oferta de pequenos primers sintéticos que são projetados
Dialogue: 0,0:01:40.00,0:01:47.00,Default,,0000,0000,0000,,para hibridizar à sequência de ligação de ambas extremidades do DNA alvo.
Dialogue: 0,0:01:47.00,0:01:53.00,Default,,0000,0000,0000,,Os primers são os ingredientes que tornam a reação específica, já que somente DNA que
Dialogue: 0,0:01:53.00,0:01:58.00,Default,,0000,0000,0000,,situa-se entre estes dois primers será sintetizado na reação de PCR.
Dialogue: 0,0:01:58.00,0:02:04.00,Default,,0000,0000,0000,,Em terceiro lugar, a reação requer uma enzima DNA polimerase.
Dialogue: 0,0:02:04.00,0:02:10.00,Default,,0000,0000,0000,,Na PCR a polimerase é na verdade obtida de uma bactéria que normalmente cresce no mar ao redor
Dialogue: 0,0:02:10.00,0:02:14.00,Default,,0000,0000,0000,,de fontes geotérmicas do fundo do oceano.
Dialogue: 0,0:02:14.00,0:02:20.00,Default,,0000,0000,0000,,A bactéria é chamada Thermus Aquaticus e a polimerase é conhecida pela abreviação
Dialogue: 0,0:02:20.00,0:02:21.00,Default,,0000,0000,0000,,Taq polimerase.
Dialogue: 0,0:02:21.00,0:02:29.00,Default,,0000,0000,0000,,Esta enzima exótica é usada porque ela não é inativada pelas altas temperaturas geradas
Dialogue: 0,0:02:29.00,0:02:31.00,Default,,0000,0000,0000,,na reação de PCR.
Dialogue: 0,0:02:31.00,0:02:38.00,Default,,0000,0000,0000,,Todos esses elementos são misturados em proporções adequadas e colocados em um instrumento chamado
Dialogue: 0,0:02:38.00,0:02:40.00,Default,,0000,0000,0000,,termociclador
Dialogue: 0,0:02:40.00,0:02:47.00,Default,,0000,0000,0000,,Este instrumento pode ser programado para alterar a temperatura da mistura através de uma série
Dialogue: 0,0:02:47.00,0:02:49.00,Default,,0000,0000,0000,,de ciclos repetitivos.
Dialogue: 0,0:02:49.00,0:02:57.00,Default,,0000,0000,0000,,A temperatura da reação nesta demonstração é apresentada no painel inferior direito.
Dialogue: 0,0:02:57.00,0:03:04.00,Default,,0000,0000,0000,,Na primeira rodada da PCR a temperatura é elevada a um ponto em que o DNA é desnaturado
Dialogue: 0,0:03:04.00,0:03:08.00,Default,,0000,0000,0000,,e as fitas complementares separam-se uma da outra.
Dialogue: 0,0:03:08.00,0:03:14.00,Default,,0000,0000,0000,,A temperatura é, em seguida, diminuída a um nível em que as fitas complementares podem se ligar novamente.
Dialogue: 0,0:03:14.00,0:03:24.00,Default,,0000,0000,0000,,No entanto, uma vez que os primers estão presentes na mistura em grande quantidade, eles
Dialogue: 0,0:03:24.00,0:03:28.00,Default,,0000,0000,0000,,tendem a se ligar aos sitios complementares quando as fitas se associam novamente.
Dialogue: 0,0:03:28.00,0:03:37.00,Default,,0000,0000,0000,,Conforme a temperatura é abaixada ainda mais, a polimerase encontra as extremidades livres dos
Dialogue: 0,0:03:37.00,0:03:44.00,Default,,0000,0000,0000,,primers e a enzima começa a adicionar nucleotídeos à extremidade do primer usando a fita
Dialogue: 0,0:03:44.00,0:03:45.00,Default,,0000,0000,0000,,complementar como modelo
Dialogue: 0,0:03:45.00,0:03:52.00,Default,,0000,0000,0000,,O mesmo processo ocorre quando o DNA se replica na divisão celular normal.
Dialogue: 0,0:03:52.00,0:04:00.00,Default,,0000,0000,0000,,No final do primeiro round da PCR haverá duas cópias da sequência-alvo para cada
Dialogue: 0,0:04:00.00,0:04:04.00,Default,,0000,0000,0000,,uma que estava presente na amostra clínica.
Dialogue: 0,0:04:04.00,0:04:12.00,Default,,0000,0000,0000,,Você pode acompanhar a amplificação no painel que aparecerá no canto inferior esquerdo.
Dialogue: 0,0:04:12.00,0:04:17.00,Default,,0000,0000,0000,,O mesmo processo é repetido na segunda rodada da PCR.
Dialogue: 0,0:04:17.00,0:04:25.00,Default,,0000,0000,0000,,O termociclador aquece drasticamente a amostra para separar as fitas complementares do DNA,
Dialogue: 0,0:04:25.00,0:04:28.00,Default,,0000,0000,0000,,incluindo aquelas que já foram sintetizadas.
Dialogue: 0,0:04:28.00,0:04:35.00,Default,,0000,0000,0000,,A temperatura é abaixada para permitir que os primers se liguem aos seus sítios específicos e para iniciar
Dialogue: 0,0:04:35.00,0:04:41.00,Default,,0000,0000,0000,,a síntese das fitas complementares pela Taq polimerase quando a temperatura é abaixada
Dialogue: 0,0:04:41.00,0:04:47.00,Default,,0000,0000,0000,,novamente.
Dialogue: 0,0:04:47.00,0:04:54.00,Default,,0000,0000,0000,,Na terceira rodada o mesmo ciclo de mudança de temperatura ocorre com a desnaturação das
Dialogue: 0,0:04:54.00,0:05:00.00,Default,,0000,0000,0000,,fitas, vinculação dos primers quando a temperatura é abaixada e síntese de uma nova fita quando
Dialogue: 0,0:05:00.00,0:05:06.00,Default,,0000,0000,0000,,as fitas são sinalizadas para a DNA-polimerase iniciar a adição de nucleotídeos.
Dialogue: 0,0:05:06.00,0:05:14.00,Default,,0000,0000,0000,,No final do terceiro round existem oito cópias de fita dupla da sequência-alvo
Dialogue: 0,0:05:14.00,0:05:18.00,Default,,0000,0000,0000,,onde originalmente havia apenas uma.
Dialogue: 0,0:05:18.00,0:05:25.00,Default,,0000,0000,0000,,O quadro expandido no canto inferior esquerdo irá mostrar agora o que acontece com ciclos sucessivos
Dialogue: 0,0:05:25.00,0:05:28.00,Default,,0000,0000,0000,,de PCR.
Dialogue: 0,0:05:28.00,0:05:34.00,Default,,0000,0000,0000,,Em cada ciclo o número de cópias da sequência alvo dobra, assim haverá dezesseis
Dialogue: 0,0:05:34.00,0:05:42.00,Default,,0000,0000,0000,,cópias após quatro ciclos, trinta e duas cópias, após cinco ciclos e sessenta e quatro cópias após
Dialogue: 0,0:05:42.00,0:05:44.00,Default,,0000,0000,0000,,seis ciclos.
Dialogue: 0,0:05:44.00,0:05:50.00,Default,,0000,0000,0000,,Quando o termociclador completar quarenta ciclos os primers e os nucleotídeos estarão
Dialogue: 0,0:05:50.00,0:05:57.00,Default,,0000,0000,0000,,provavelmente exauridos, mas teoricamente haverá 10 elevado a 12 cópias.
Dialogue: 0,0:05:57.00,0:06:03.00,Default,,0000,0000,0000,,A seqüência-alvo terá sido amplificada um trilhão de vezes.
Dialogue: 0,0:06:03.00,0:06:11.00,Default,,0000,0000,0000,,Este nível de amplificação produz uma quantidade de DNA específico que agora pode ser visualizado
Dialogue: 0,0:06:11.00,0:06:14.00,Default,,0000,0000,0000,,por eletroforese em gel.
Dialogue: 0,0:06:14.00,0:06:22.00,Default,,0000,0000,0000,,A grande mancha de DNA no topo do gel representa o DNA complexo que estava presente
Dialogue: 0,0:06:22.00,0:06:24.00,Default,,0000,0000,0000,,na amostra clínica.
Dialogue: 0,0:06:24.00,0:06:34.00,Default,,0000,0000,0000,,No entanto, uma nova banda menor aparece em amostras colhidas nos ciclos posteriores da PCR.
Dialogue: 0,0:06:34.00,0:06:43.00,Default,,0000,0000,0000,,Para diagnóstico laboratorial o DNA amplificado pode ser detectado e quantificado por
Dialogue: 0,0:06:43.00,0:06:49.00,Default,,0000,0000,0000,,métodos mais simples e eficientes do que a eletroforese em gel.
Dialogue: 0,0:06:49.00,0:06:53.00,Default,,0000,0000,0000,,Um desses métodos é discutido em um próximo programa.