Measuring Serum Antibody with an Agglutination Assay

This short animation demonstrates measuring serum antibody with an agglutination assay. This resource was developed by Cary Engleberg of the University of Michigan. It is part of a larger learning module about laboratory methods for clinical microbiology. The full learning module, editable animation, and video transcript are available at http://open.umich.edu/education/med/oernetwork/med/microbiology/clinical-microbio-lab/2009. Copyright 2009-2010, Cary Engleberg. This is licensed under a Creative Commons Attribution Noncommercial 3.0 License http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/.

(Portuguese/Português translation by Ana Julia Perrotti-Garcia, FFLCH USP SP, Freelance Translator & Interpreter)
Um ensaio de aglutinação é um modo simples de detectar e medir anticorpos

em uma amostra clínica, contra um antígeno específico.

Nesta animação serão demonstrados os princípios e as armadilhas potenciais do ensaio.

O principal reagente utilizado no ensaio é uma solução de pequenas pérolas insolúveis

geralmente compostas de látex.

Alternativamente, para medir anticorpos contra um agente patogênico microbiano pode-se usar

bactérias mortas ou células de levedura como partículas aglutinantes.

Mas, neste exemplo, usamos pérolas de látex, preparadas de modo a

serem revestidas pelo antígeno pesquisado e tenham uma concentração suficiente

para produzir uma suspensão leitosa visível.

Para medir anticorpos contra o antígeno, as partículas são adicionadas aos orifícios

de uma placa de microtitulação com 96 orifícios. Adiciona-se soro de diferentes pacientes

aos orifícios da primeira coluna.

Duas diluições dos soros são preparadas nas fileiras.

Então, adiciona-se soro de controle positivo e negativo nas últimas duas colunas.

Quando a placa é incubada à temperatura ambiente,

os orifícios com controle negativo ficam inalterados.

Os orifícios com controle positivo formam um botão visível no fundo

e a solução nesses orifícios passa de leitosa para translúcida.

Então, o que explica o aparecimento de orifícios positivos

e o que explica a falta de alteração nos orifícios negativos?

Para entender o que acontece, vamos analisar a aparência microscópica

dos orifícios positivos e negativos, para ver o que acontece em cada caso.

Quando não existem anticorpos no orifícios, as pérolas permanecem em suspensão

conferindo-lhe um aspecto leitoso.

Mas, quando está presente um anticorpo específico. há união das pérolas e forma-se um reticulado.

Isto faz com que as pérolas se aglutinem e formam-se grandes agregados que precipitam

para o fundo arredondado dos orifícios.

A suspensão, que era leitosa, fica translúcida pela precipitação dos complexos,

e os agregados formam uma pastilha ou um botão no fundo do orifício.

Então, há a formação de um botão no fundo dos orifícios

com anticorpos específicos suficientes para precipitar as pérolas.

Mas quando o anticorpo está muito diluído, não há precipitação.

Os títulos de anticorpos de um paciente são a última diluição de soro capaz de produzir precipitação.

Mas, como se explica a ausência de precipitação nos orifícios mais concentrados,

com soro com títulos mais altos, mostrados pela seta laranja?

Imagine um orifício que tem muito mais moléculas de anticorpo do que pérolas.

As pérolas vão ser totalmente revestidas por anticorpos

e não haverá possibilidade de reticulação e precipitação.

Este fenômeno, chamado de pró-zona, às vezes ocorre em casos de sífilis.

O teste de triagem padrão para sífilis é um ensaio de aglutinação

Adiciona-se soro não diluído às pérolas revestidas com o antígeno cardiolipina.

Na sífilis secundária, os títulos de anticorpos às vezes são tão altos

que o teste exibe uma pró-zona e o resultado é falso negativo.

Então, como podemos superar este problema potencial

e fazer um diagnóstico laboratorial correto?

Que tal diluir o soro e depois testar novamente?

Diluindo o anticorpo, neste caso, as quantidades de anticorpos e antígenos

tornam-se praticamente equivalentes.

Assim, existem condições para reticulação.

Quando ocorre a reticulação, forma-se um precipitado e desenvolve-se um botão

no fundo do tubo, que indica um teste positivo.