Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR)

This short animation introduces the real-time polymerase chain reaction (PCR) procedure. Captions are available in English. This resource was developed by Yaw Adu-Sarkodie of the Kwame Nkrumah University of Science and Technology and Cary Engleberg of the University of Michigan. It is part of a larger learning module about laboratory methods for clinical microbiology. The full learning module, editable animation, and video transcript are available at http://open.umich.edu/education/med/oernetwork/med/microbiology/clinical-microbio-lab/2009). Copyright 2009-2010, Kwame Nkrumah University of Science and Technology and Cary Engleberg. This is licensed under a Creative Commons Attribution Noncommercial 3.0 License http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/.

(Danish translation by Beatrix M. G. Nielsen, University of Copenhagen)
Dette program viser, hvordan en specifik nukleinsyresekvens i en klinisk prøve kan spores

og kvantificeres ved anvendelse af PCR (Polymerase Chain Reaktion, på dansk polymerasekædereaktion).

Dette opnås ved at registrere akkumuleringen af de amplificerede PCR-produkter, som de bliver

dannet i reaktionen.

Derfor kaldes processen RealTid (Real-Time), eller RTPCR.

For at forstå hvordan amplificerede PCR-produkter, også kaldet amplikoner, spores i realtid,

så lad os først betragte de hændelser, som forekommer ved en normal cyklus af PCR-reaktionen.

Husk, at det første trin i en PCR-cyklus er at øge reaktionstemperaturen og derved smelte

dobbeltstrenget DNA.

Så, når temperaturen sænkes, binder de specifikke primere til sekvenserne i

hver ende af mål-DNA'et.

Det mellemliggende DNA kan derefter syntetiseres ved polymerasereaktion i modsatte retninger.

Som resultat producerer du to dobbelt-strengede kopier af mål-DNA'et, hvor du til at begyndte med

kun havde én.

Hvis en del af denne grundlæggende proces fovirrer dig, kan det være en god ide at gennemgå

programmet om grundlæggende PCR igen.

For at spore dannelsen af nye amplikoner i realtid, har PCR-reaktionen brug for

noget yderligere - en enkeltstrenget DNA-probe, designet til at binde sig til en del af den

DNA-sekvens, der bliver syntetiseret mellem de to primere.

Men i modsætning til primerene, er denne probe mærket mere specifikt. En af dens

nukleotider er mærket med et fluorescerende molekyle og et andet nucleotid er mærket

med et fluorescerende quencher-molekyle. (to quench betyder "at slukke")

Quencheren absorberer hurtigt al lysenergi, der udsendes af det fluorescerende molekyle, så længe

molekylet forbliver meget tæt på quencheren.

Lad os nu se, hvad der sker, når denne ekstra ingrediens er tilstede under en

enkelt cyklus af PCR.

Andre primere binder til de separate strenge af DNA.

Proben finder også sin komplimentære sekvens imellem dem.

Enzymet syntetiserer nyt DNA fra enderne af primerne, men har også en anden aktivitet:

en exonucleus aktivitet. (exo betyder "ud" eller "udenfor", nucleus betyder "cellekerne", så exonucleus betyder "udenfor cellekernen")

Så når enzymet støder på dobbeltstrenget DNA, vil det skille strengen,

som er i vejen ad, og erstatte alle nukleotiderne.

Bemærk at mens polymerasen passere gennem proben, bliver nukleotidet, som bærer den fluorescerende

markør og nukleotidet der bærer quencheren adskilt fra hinanden.

I mangel af en nærliggende quencher, kan det fluorescerende molekyle nu udsende målbart lys, når

det bliver stimuleret.

Hver gang en amplikon produceres, bliver endnu en fluorescerende markør frigivet fra dets naboliggende

quencher.

Derfor, ligesom at antallet af amplikoner fordobles i hver PCR-cyklus, bliver mængden af emitteret

fluorescerende energi også fordoblet.

Denne produktion af lys kan overvåges under PCR-reaktionen i et termisk cykliseringsapparat, der er udstyret

med et fluorometer.

Så hvis man starter med en klinisk prøve, der kun har én kopi af mål-DNA'et, kan det

tage 40 eller flere cykler, før amplikonerne kan måles ved et fluorometer i et specialiseret

termisk cykliseringsapparat.

Derimod, hvis den oprindelige prøve indeholder 32 kopier af mål-DNA'et, så

kan amplikonerne måles på fluorometeret efter 5 færre runder af PCR.

Og hvis der er 1024 mål-DNA-sekvenser i den oprindelige prøve, så bliver det fluorescerende

signal målbart 10 runder tidligere.

Så mængden af specifik DNA i den kliniske prøve bestemmes ved

runden af PCR, hvor mængden af fluorescens bliver målbar.

RTPCR bliver oftest anvendt til at kvantificere mængden af virus i blodet hos patienter

med HIV, Hepatitis B og andre vira.

Men HIV er et RNA-virus, det har ingen DNA og RNA'et, som det har, er enkeltstrenget.

Så hvordan kan denne metode virke?

Svaret er, at RNA fra et RNA-virus, kan kvantificeres efter at det er blevet kopieret

og omdannet til dobbeltstrenget DNA.

Denne animation viser, hvordan dette opnås. Først bliver det virale RNA frigivet fra

virionet.

Derefter bliver en komplimentær DNA-streng syntetiseret ud fra det virale RNA med renset

revers transkriptase, ligesom den gør i en naturlig replikation.

I nogle protokoller, bliver et specialiceret RNAse enzym derefter tilsat for at gøre det muligt for RNA'et

at blive nedbrudt.

Ligemeget om dette er en del af proceduren eller ej, er det næste afgørende skridt, når en DNA-polymerase

og en primer danner en komplimentær DNA-streng, ligesom i PCR-reaktionen.

Ved afslutningen af denne reaktion, er et enkeltstrenget virus-RNA blevet omdannet til et dobbeltstrenget

DNA, som har samme sekvens af nukleotidbaser.

Den kvalitative PCR-reaktion kan forløbe som beskrevet tidligere.