[Script Info]
Title: 
[Events]
Format: Layer, Start, End, Style, Name, MarginL, MarginR, MarginV, Effect, Text
Dialogue: 0,0:00:02.03,0:00:09.06,Default,,0000,0000,0000,,(Danish translation by Beatrix M. G. Nielsen, University of Copenhagen)\NDette program viser, hvordan en specifik nukleinsyresekvens i en klinisk prøve kan spores
Dialogue: 0,0:00:09.06,0:00:12.54,Default,,0000,0000,0000,,og kvantificeres ved anvendelse af PCR (Polymerase Chain Reaktion, på dansk polymerasekædereaktion).
Dialogue: 0,0:00:12.54,0:00:19.95,Default,,0000,0000,0000,,Dette opnås ved at registrere akkumuleringen af de amplificerede PCR-produkter, som de bliver
Dialogue: 0,0:00:19.95,0:00:23.37,Default,,0000,0000,0000,,dannet i reaktionen.
Dialogue: 0,0:00:23.37,0:00:29.10,Default,,0000,0000,0000,,Derfor kaldes processen RealTid (Real-Time), eller RTPCR.
Dialogue: 0,0:00:29.10,0:00:38.06,Default,,0000,0000,0000,,For at forstå hvordan amplificerede PCR-produkter, også kaldet amplikoner, spores i realtid,
Dialogue: 0,0:00:38.06,0:00:46.05,Default,,0000,0000,0000,,så lad os først betragte de hændelser, som forekommer ved en normal cyklus af PCR-reaktionen.
Dialogue: 0,0:00:46.05,0:00:53.04,Default,,0000,0000,0000,,Husk, at det første trin i en PCR-cyklus er at øge reaktionstemperaturen og derved smelte
Dialogue: 0,0:00:53.04,0:00:55.09,Default,,0000,0000,0000,,dobbeltstrenget DNA.
Dialogue: 0,0:00:55.09,0:01:03.01,Default,,0000,0000,0000,,Så, når temperaturen sænkes, binder de specifikke primere til sekvenserne i
Dialogue: 0,0:01:03.01,0:01:06.08,Default,,0000,0000,0000,,hver ende af mål-DNA'et.
Dialogue: 0,0:01:06.08,0:01:15.01,Default,,0000,0000,0000,,Det mellemliggende DNA kan derefter syntetiseres ved polymerasereaktion i modsatte retninger.
Dialogue: 0,0:01:15.01,0:01:21.73,Default,,0000,0000,0000,,Som resultat producerer du to dobbelt-strengede kopier af mål-DNA'et, hvor du til at begyndte med
Dialogue: 0,0:01:21.73,0:01:23.03,Default,,0000,0000,0000,,kun havde én.
Dialogue: 0,0:01:23.03,0:01:30.23,Default,,0000,0000,0000,,Hvis en del af denne grundlæggende proces fovirrer dig, kan det være en god ide at gennemgå
Dialogue: 0,0:01:30.23,0:01:35.50,Default,,0000,0000,0000,,programmet om grundlæggende PCR igen.
Dialogue: 0,0:01:35.50,0:01:41.07,Default,,0000,0000,0000,,For at spore dannelsen af nye amplikoner i realtid, har PCR-reaktionen brug for
Dialogue: 0,0:01:41.07,0:01:50.02,Default,,0000,0000,0000,,noget yderligere - en enkeltstrenget DNA-probe, designet til at binde sig til en del af den
Dialogue: 0,0:01:50.02,0:01:54.33,Default,,0000,0000,0000,,DNA-sekvens, der bliver syntetiseret mellem de to primere.
Dialogue: 0,0:01:54.33,0:02:02.53,Default,,0000,0000,0000,,Men i modsætning til primerene, er denne probe mærket mere specifikt. En af dens
Dialogue: 0,0:02:02.53,0:02:11.00,Default,,0000,0000,0000,,nukleotider er mærket med et fluorescerende molekyle og et andet nucleotid er mærket
Dialogue: 0,0:02:11.00,0:02:16.00,Default,,0000,0000,0000,,med et fluorescerende quencher-molekyle. (to quench betyder "at slukke")
Dialogue: 0,0:02:16.00,0:02:23.06,Default,,0000,0000,0000,,Quencheren absorberer hurtigt al lysenergi, der udsendes af det fluorescerende molekyle, så længe
Dialogue: 0,0:02:23.06,0:02:27.46,Default,,0000,0000,0000,,molekylet forbliver meget tæt på quencheren.
Dialogue: 0,0:02:27.46,0:02:36.16,Default,,0000,0000,0000,,Lad os nu se, hvad der sker, når denne ekstra ingrediens er tilstede under en
Dialogue: 0,0:02:36.16,0:02:39.77,Default,,0000,0000,0000,,enkelt cyklus af PCR.
Dialogue: 0,0:02:39.77,0:02:44.10,Default,,0000,0000,0000,,Andre primere binder til de separate strenge af DNA.
Dialogue: 0,0:02:44.10,0:02:49.03,Default,,0000,0000,0000,,Proben finder også sin komplimentære sekvens imellem dem.
Dialogue: 0,0:02:49.03,0:02:56.63,Default,,0000,0000,0000,,Enzymet syntetiserer nyt DNA fra enderne af primerne, men har også en anden aktivitet:
Dialogue: 0,0:02:56.63,0:03:00.72,Default,,0000,0000,0000,,en exonucleus aktivitet. (exo betyder "ud" eller "udenfor", nucleus betyder "cellekerne", så exonucleus betyder "udenfor cellekernen")
Dialogue: 0,0:03:00.72,0:03:07.41,Default,,0000,0000,0000,,Så når enzymet støder på dobbeltstrenget DNA, vil det skille strengen,
Dialogue: 0,0:03:07.41,0:03:12.10,Default,,0000,0000,0000,,som er i vejen ad, og erstatte alle nukleotiderne.
Dialogue: 0,0:03:12.10,0:03:18.38,Default,,0000,0000,0000,,Bemærk at mens polymerasen passere gennem proben, bliver nukleotidet, som bærer den fluorescerende
Dialogue: 0,0:03:18.38,0:03:24.08,Default,,0000,0000,0000,,markør og nukleotidet der bærer quencheren adskilt fra hinanden.
Dialogue: 0,0:03:24.08,0:03:32.30,Default,,0000,0000,0000,,I mangel af en nærliggende quencher, kan det fluorescerende molekyle nu udsende målbart lys, når
Dialogue: 0,0:03:32.30,0:03:34.10,Default,,0000,0000,0000,,det bliver stimuleret.
Dialogue: 0,0:03:34.10,0:03:41.10,Default,,0000,0000,0000,,Hver gang en amplikon produceres, bliver endnu en fluorescerende markør frigivet fra dets naboliggende
Dialogue: 0,0:03:41.10,0:03:43.02,Default,,0000,0000,0000,,quencher.
Dialogue: 0,0:03:43.02,0:03:50.30,Default,,0000,0000,0000,,Derfor, ligesom at antallet af amplikoner fordobles i hver PCR-cyklus, bliver mængden af emitteret
Dialogue: 0,0:03:50.30,0:03:52.96,Default,,0000,0000,0000,,fluorescerende energi også fordoblet.
Dialogue: 0,0:03:52.96,0:04:00.06,Default,,0000,0000,0000,,Denne produktion af lys kan overvåges under PCR-reaktionen i et termisk cykliseringsapparat, der er udstyret
Dialogue: 0,0:04:00.06,0:04:02.01,Default,,0000,0000,0000,,med et fluorometer.
Dialogue: 0,0:04:02.01,0:04:08.69,Default,,0000,0000,0000,,Så hvis man starter med en klinisk prøve, der kun har én kopi af mål-DNA'et, kan det
Dialogue: 0,0:04:08.69,0:04:15.05,Default,,0000,0000,0000,,tage 40 eller flere cykler, før amplikonerne kan måles ved et fluorometer i et specialiseret
Dialogue: 0,0:04:15.05,0:04:16.05,Default,,0000,0000,0000,,termisk cykliseringsapparat.
Dialogue: 0,0:04:16.05,0:04:24.01,Default,,0000,0000,0000,,Derimod, hvis den oprindelige prøve indeholder 32 kopier af mål-DNA'et, så
Dialogue: 0,0:04:24.01,0:04:30.07,Default,,0000,0000,0000,,kan amplikonerne måles på fluorometeret efter 5 færre runder af PCR.
Dialogue: 0,0:04:30.07,0:04:38.00,Default,,0000,0000,0000,,Og hvis der er 1024 mål-DNA-sekvenser i den oprindelige prøve, så bliver det fluorescerende
Dialogue: 0,0:04:38.00,0:04:42.14,Default,,0000,0000,0000,,signal målbart 10 runder tidligere.
Dialogue: 0,0:04:42.14,0:04:48.02,Default,,0000,0000,0000,,Så mængden af specifik DNA i den kliniske prøve bestemmes ved
Dialogue: 0,0:04:48.02,0:04:56.82,Default,,0000,0000,0000,,runden af PCR, hvor mængden af fluorescens bliver målbar.
Dialogue: 0,0:04:56.82,0:05:04.04,Default,,0000,0000,0000,,RTPCR bliver oftest anvendt til at kvantificere mængden af virus i blodet hos patienter
Dialogue: 0,0:05:04.04,0:05:08.45,Default,,0000,0000,0000,,med HIV, Hepatitis B og andre vira.
Dialogue: 0,0:05:08.45,0:05:19.29,Default,,0000,0000,0000,,Men HIV er et RNA-virus, det har ingen DNA og RNA'et, som det har, er enkeltstrenget.
Dialogue: 0,0:05:19.29,0:05:23.06,Default,,0000,0000,0000,,Så hvordan kan denne metode virke?
Dialogue: 0,0:05:23.06,0:05:30.06,Default,,0000,0000,0000,,Svaret er, at RNA fra et RNA-virus, kan kvantificeres efter at det er blevet kopieret
Dialogue: 0,0:05:30.06,0:05:34.00,Default,,0000,0000,0000,,og omdannet til dobbeltstrenget DNA.
Dialogue: 0,0:05:34.00,0:05:42.39,Default,,0000,0000,0000,,Denne animation viser, hvordan dette opnås. Først bliver det virale RNA frigivet fra
Dialogue: 0,0:05:42.39,0:05:43.51,Default,,0000,0000,0000,,virionet.
Dialogue: 0,0:05:43.51,0:05:51.10,Default,,0000,0000,0000,,Derefter bliver en komplimentær DNA-streng syntetiseret ud fra det virale RNA med renset
Dialogue: 0,0:05:51.10,0:05:56.02,Default,,0000,0000,0000,,revers transkriptase, ligesom den gør i en naturlig replikation.
Dialogue: 0,0:05:56.02,0:06:06.02,Default,,0000,0000,0000,,I nogle protokoller, bliver et specialiceret RNAse enzym derefter tilsat for at gøre det muligt for RNA'et
Dialogue: 0,0:06:06.02,0:06:08.00,Default,,0000,0000,0000,,at blive nedbrudt.
Dialogue: 0,0:06:08.00,0:06:15.54,Default,,0000,0000,0000,,Ligemeget om dette er en del af proceduren eller ej, er det næste afgørende skridt, når en DNA-polymerase
Dialogue: 0,0:06:15.54,0:06:22.07,Default,,0000,0000,0000,,og en primer danner en komplimentær DNA-streng, ligesom i PCR-reaktionen.
Dialogue: 0,0:06:22.07,0:06:31.67,Default,,0000,0000,0000,,Ved afslutningen af denne reaktion, er et enkeltstrenget virus-RNA blevet omdannet til et dobbeltstrenget
Dialogue: 0,0:06:31.67,0:06:37.02,Default,,0000,0000,0000,,DNA, som har samme sekvens af nukleotidbaser.
Dialogue: 0,0:06:37.02,0:06:42.61,Default,,0000,0000,0000,,Den kvalitative PCR-reaktion kan forløbe som beskrevet tidligere.