Resolução de mistérios médicos

O bioquímico Joe DeRisi fala sobre inovadoras formas de diagnosticar vírus (e tratar as doenças que causam) utilizando ADN. O seu trabalho pode ajudar a perceber a malária, SARS, a gripe das aves e 60% das infecções virais diárias que escapam ao diagnóstico.

Como é que, como podemos nós investigar

esta diversidade de vírus que nos rodeiam, e ajudar a medicina?

Como podemos transformar o nosso conhecimento cumulativo de virologia

num instrumento de diagnóstico simples e possível de segurar numa mão?

Quero transformar tudo o que sabemos neste momento sobre detectar vírus

e sobre o espectro de vírus que por aí anda

em, digamos, um pequeno chip.

Quando começámos a pensar sobre este projecto,

como iríamos construir um instrumento simples de diagnóstico

para analisar em simultâneo todos os agentes patogénicos,

bem, surgiram alguns problemas com esta ideia.

Em primeiro lugar, os vírus são bastante complexos,

e também evoluem bastante depressa.

Isto é um picornavírus.

Picornavírus - estes incluem

a constipação comum e a pólio, e assim.

Estamos a observar a cápsula exterior do vírus,

e esta cor amarela aqui são regiões do vírus

que evoluem muito, muito rapidamente,

e as regiões azuis não estão a evoluir muito depressa.

Quando se tentam fazer reagentes de detecção pan-viral,

geralmente o maior problema decorre da evolução rápida,

porque como podemos nós detectar estruturas se elas estão sempre a mudar?

Mas a evolução é um equilíbrio:

onde ocorrem mudanças rápidas, também existe ultra-conservação,

coisas que quase nunca mudam.

Então olhámos para isto um pouco mais atentamente,

e agora vou mostrar-vos alguma informação.

Isto são somente algumas coisas que vocês podiam fazer com o computador da vossa secretária.

Peguei nuns quantos destes pequenos picornavírus,

como a constipação comum, a pólio e por aí adiante,

e quebrei-os em pequenos segmentos,

e então peguei neste primeiro exemplo, que é chamado de coxsackievírus,

e parti-o em pequenas aberturas.

E estou a colorir essas pequenas aberturas de azul

se outro vírus partilhar uma sequência idêntica no seu genoma

com a desse vírus.

Estas sequências aqui,

que nem sequer codificam proteínas, a propósito,

são praticamente idênticas entre todos estes,

então posso utilizar esta sequência como um marcador

para detectar um vasto espectro de vírus,

sem ter que construir algo específico.

Agora, aqui existe grande diversidade:

é onde tudo evolui rapidamente.

Aqui podem observar uma evolução mais lenta: menor diversidade.

Agora, quando nós aqui chegarmos, digamos,

ao vírus da paralisia aguda das abelhas,

provavelmente um mau vírus a ter se forem abelhas,

este vírus não partilha praticamente nenhuma similaridade com o coxsackevírus,

mas posso garantir-vos que as sequências que são mais conservadas

entre estes vírus no lado direito do ecrã

encontram-se em regiões idênticas aqui.

E então nós podemos encapsular estas regiões de ultra-conservação

através da evolução, como estes vírus evoluíram,

escolhendo somente elementos de ADN ou ARN

nestas regiões para representar no nosso chip como reagentes de detecção.

Sim, então foi assim que fizémos, mas como fomos nós fazer isso?

Bem, durante muito tempo, desde que eu andava na faculdade,

tenho andado entretido a construir chips de ADN,

isto é, a imprimir ADN em vidro.

E é isso que vêm aqui:

Estas pequenas manchas são apenas ADN impresso em vidro,

e eu posso colocar milhares nos chips de vidro

e utilizá-las como reagentes de detecção.

Levámos o nosso chip à Hewlett-Packard

e utilizámos o microscópio de força atómica num destes pontos,

e isto é o que é visível:

podem ver-se as cadeias de ADN estendidas sobre o vidro.

Então, o que nós estamos a fazer é imprimir ADN em vidro,

pequenas coisas achatadas, que vai servir de marcador para patogénios.

Assim, contruí pequenos robôs no laboratório para montar os chips,

e sou um adepto da disseminação da tecnologia.

Se têm dinheiro suficiente para comprar uma Camry,

também podem contruir isto,

por isso disponibilizamos um manual de instruções compleno na web, gratuitamente,

basicamente com a indicação das peças a encomendar,

podem construir uma máquina de microarrays na garagem.

Aqui está a secção dos imprescindíveis botões stop de emergência.

(Risos)

Qualquer máquina importante tem de ter um grande botão vermelho.

Agora a sério, é bastante resistente.

Podiam de facto estar a fazer chips de ADN na vossa garagem,

e a descodificar alguns programas genéticos rapidamente. É bastante divertido.

(Risos)

E então o que fizémos, e este é um projecto muito interessante,

começámos por fazer um chip de vírus respiratórios.

Eu falei sobre,

sabem, a situação em que se dirigem a uma clínica

e não são diagnosticados?

Bem, nós pusémos basicamente todos os vírus respiratórios humanos

num chip, e aproveitámos e pusémos também o vírus do herpes por precaução,

quer dizer, porque não?

A primeira coisa que fazem enquanto cientistas é,

têm de se certificar que o teste funciona.

Então fizémos uma cultura de células

e infectámo-la com vários vírus,

e pegámos na preparação e marcámos por flurescência o ácido nucleico,

o material genético que obtivémos dessa cultura celular -

sobretudo material viral - e colocámo-lo sobre o chip para ver onde hibridava.

Agora, se as sequências de ADN corresponderem, elas ficam unidas,

e então podemos depois ir ver os pontos.

E se alguns pontos emitirem flurescência, sabemos que existe um certo vírus lá.

Este é o aspecto de um desses chips,

e estes pontos vermelhos são de facto sinal proveniente do vírus.

E cada ponto representa uma família diferente de vírus

ou espécies de vírus.

Assim, esta é uma forma complicada de ver o resultado,

então eu vou apenas codificar a informação como um pequeno código de barras,

agrupado por famílias, para que possam ver os resultados de uma forma mais intuitiva.

O que fizémos foi, pegámos em culturas de células de tecido

e infectámo-las com adenovírus,

e podem ver este pequeno código de barras amarelo próximo do adenovírus.

E, de forma semelhante, infectámos com parainfluenza-3 -

um paramyxovírus - e vêm um pequeno código de barras aqui.

Depois fizémos com o vírus sincicial respiratório.

O flagelo dos centros de dia por toda a parte -

é o "bicho papão", basicamente.

(Risos)

Podem ver que este código de barras é da mesma família,

mas é distinto do parainfluenza-3,

que vos dá uma má constipação.

E assim obtemos assinaturas únicas, uma impressão digital para cada vírus.

O pólio e o rino: estão ambas na mesma família, muito perto uma da outra.

Rino é a constipação comum, e todos sabem o que é a Pólio,

e podem verificar que estas assinaturas são diferentes.

E o vírus do herpes associado ao sarcoma de Kaposi

dá-nos uma bela assinatura aqui.

E não é uma risca qualquer ou assim

que me diz que tenho um vírus de um determinado tipo aqui;

é o código de barras que no seu todo representa essa informação.

Está bem, eu posso ver um rinovírus -

e aqui está ampliado do código de barras do rinovírus -

mas então e diferentes rinovírus?

Como sei que rinovírus tenho?

Existem 102 variantes da constipação comum,

e são apenas 102 porque as pessoas se fartaram de os catalogar:

surgem novos todos os anos.

Aqui estão quatro rinovírus diferentes,

e podem ver, até com os vossos olhos,

sem qualquer programa especial de reconhecimento

de padrões semelhantes através de algorítmos,

que é possível distinguir estes códigos de barras um do outro.

Agora, este é uma espécie de exemplo base,

porque eu sei qual é a sequência genética de todos estes rinovírus,

e de facto eu desenhei o chip

propositadamente para ser possível diferenciá-los,

mas e então rinovírus que nunca viram um sequenciador genético?

Não sabemos qual é a sequência; apenas os obtivémos.

Aqui temos então quatro rinovírus

dos quais nunca soubémos nada -

nunca ninguém os sequenciou - e também podem ver

que obtém padrões únicos e distinguíveis.

Podem imaginar a construção de uma biblioteca, real ou virtual,

de impressões digitais de basicamente todos os vírus.

Mas isso é, de novo, caçar galinhas na capoeira, entendem?

Têm tecidos em cultura celular: existem centenas de vírus.

E então com pessoas a sério?

Não podem controlar pessoas a sério, como provavelmente têm conhecimento.

Não fazem ideia do que uma pessoa vai tossir para um copo,

e é decerto muito complexo, não?

Pode ter inúmeras bactérias, mais do que um vírus,

e certamente tem material genético do hospedeiro,

então como lidamos nós com isso?

E como fazemos nós o controlo positivo nesta situação?

Bem, é simples.

Este sou eu, a fazer uma lavagem nasal.

E a ideia é experimentalmente inocular pessoas com vírus

para nós - a propósito tudo isto é aprovado pelo comité de ética IRB, foram pagos.

E basicamento nós experimentalmente inoculámos pessoas

com o vírus da constipação comum.

Ou, melhor ainda, pegámos só em pessoas

directamente da sala das urgências -

com infecções do tracto respiratório adquiridas na comunidade e indefinidas.

Não fazem ideia do que entra pela porta.

Então, vamos começar primeiro pelo controlo positivo,

onde sabemos que a pessoa estava saudável.

Elas receberam uma dose de vírus pelo nariz,

vamos ver o que acontece.

Dia 0: nada acontece.

Estão saudáveis, estão limpas - é fantástico.

Na realidade, pensámos que o tracto nasal pudesse estar cheio de vírus

mesmo quando andam por aí saudáveis.

É bastante limpo. Se estão saudáveis, estão bastante saudáveis.

Dia 2: surge um padrão consistente com rinovírus,

e é bastante similar ao obtido em laboratório

durante a experiência com tecidos em cultura celular.

Fantástico, mas de novo, tiro fácil, não é?

Pusémos uma quantidade de vírus no nariz deste indivíduo. Então,

(Risos)

quero dizer, queríamos que funcionasse. Quero dizer, ele teve mesmo uma constipação.

Mas, e então com as pessoas apanhámos à saída da rua?

Aqui estão dois indivíduos representados pelos seus códigos de identificação anónimos.

Ambos têm rinovírus; nunca vimos este padrão no laboratório.

Sequenciámos partes dos seus vírus;

são novos rinovírus que nunca ninguém houvera visto.

Lembrem-se, as nossas sequências evolucionárias conservadas

que estamos a usar neste teste permitem-nos detectar

mesmo vírus novos e não classificados,

porque nós escolhemos o que é conservado durante a evolução.

Aqui está outro indivíduo. Podem jogar vocês próprios ao diagnóstico aqui.

Estes diferentes blocos representam

os diferentes vírus na família do paramixovírus,

pelo que podem percorrer os blocos

e ver onde está o sinal, percebem.

Bem, não tem cinomose canina; o que é provavelmente bom sinal.

(Risos)

Mas quando chegarem ao bloco nove,

encontram o vírus sincicial respiratório.

Talvez tenham filhos. E aí podem ver, também,

o mebro familiar relacionado: o vírus sincicial respiratório aparece aqui.

Fantástico.

Aqui está um outro indivíduo, a que foram recolhidas amostras em dois dias distintos -

visitas repetidas à clínica.

Este indíviduo tem parainfluenza-1,

e podem verificar que existe uma pequena risca aqui

para o vírus Sendai: o parainfluenza dos ratos.

As relações genéticas são muito próximas. É muito interessanto.

Então, nós construímos o chip.

Criámos um chip com todos os vírus conhecidos.

Porque não? Todos os vírus das plantas, todos os vírus dos insectos, todos os vírus marinhos.

Tudo o que conseguimos descobrir no GenBank,

ou seja, no repositório nacional de sequências.

Actualmente estamos a utilizar este chip. E para que o estamos nós a utilizar?

Bem, em primeiro lugar, quando têm um grande chip como este,

precisam de um pouco mais de informática,

para isso desenhámos um sistema para automatizar o diagnóstico.

E a ideia é, simplesmente temos padrões virtuais,

porque nunca vamos conseguir arranjar amostras de todos os vírus;

seria virtualmente impossível. Mas podemos ter padrões virtuais,

e compará-los com o nosso resultado observado,

que é uma complexa mistura, e nos fornece uma espécie de pontuação

sobre quão provável é isto ser um rinovírus ou algo do género.

E é com isto que se parece.

Se, por exempli usaram um cultura celular

está cronicamente infectada com papiloma

recebem uma notificação do computador,

e o nosso algorítmo diz que é provavelmente papiloma tipo 18.

E é, de facto, com o que estas culturas celulares em particular

estão cronicamente infectadas.

Vamos então fazer algo um pouco mais complicado.

Pusémos o beeper na clínica.

Quando alguém surge, e o hospital não sabe o que fazer

porque não o conseguem diagnosticar, eles contactam-nos.

É essa a ideia, e nós estamos a implementá-la na zona baixa.

E assim, foi-nos reportado este caso há três semanas.

Temos uma mulher de 28 anos saudável, sem historial de viagens,

não fuma, não bebe.

Com febre há 10 dias, suores nocturnos, sangue na expectoração -

tem tossido sangue - dores musculares.

Dirigiu-se à clínica e deram-lhe antibióticos, certo,

e enviaram-na para casa.

Regressou após 10 dias de febre, certo, ainda tem febre,

e está hipóxica - não tem muito oxigénio nos pulmões.

Fizeram uma TAC.

Um pulmão normal é por regra escuro e preto aqui.

Esta coloração branca, não é boa.

Esta espécie de árvore e vesículas indica que existe inflamação;

é provável que exista uma infecção.

Certo. Então, o paciente foi depois tratado

com um antibiótico cefalosporin de terceira geração, e doxiciclina,

e no terceiro dia, sem se resolver: ela progrediu para falha aguda.

Tiveram que intubá-la, então colocaram-lhe um tubo na garganta

e começaram a ventilá-la mecânicamente.

Não conseguia respirara autonomamente.

O que fazer a seguir? Não se sabe.

Mudar de antibióticos, então eles mudaram-lhe os antibióticos,

e Tamiflu, que -

não é claro porque pensaram que tinha gripe -

mas administraram-lhe Tamiflu.

E ao sexto dia, basicamente atiraram a toalha ao chão.

Só se recorre a uma biópsia de pulmões abertos quando não existem outras alternativas.

Existe uma mortalidade de 8% só associada a este procedimento,

e basicamente - o que aprenderam eles com ele?

Estão a olhar para a biópsia de pulmão aberto.

E eu não sou patologista, mas não se pode dizer muito a partir disto.

Tudo o que podem dizer é, há uma grande inflamação: bronquiolite.

Não foi esclarecedor: foi o relatório do patologista.

E assim, a que a testaram?

Eles tinham os seus próprios testes, claro,

e testaram-na para mais de 70 ensaios diferentes,

para todos os tipos de batérias e fungos e vírus cujos ensaios

se podem encomendar:

SARS, metapneumovirus, VIH, RSV - todos estes.

Todos voltaram negativos. Testes no valor de mais de 100,000 dólares.

Isto é, foram aos limites por esta mulher.

E ao oitavo dia de internamento, foi quando nos contactaram.

Forneceram-nos um aspirado endotraqueal -

compreendem, algum fluído da garganta,

do tubo que lá inseriram - e deram-nos isto.

Pusemo-lo no chip; o que vemos? Bem, vemos parainfluenza-4.

Mas, que diabo é parainfluenza-4?

Ninguém faz testes para parainfluenza-4. No one cares about it.

De facto, nem sequer é sequenciada frequentemente.

Existe apenas uma porção sequenciada.

Não existe praticamente epidemiologia ou estudos sobre ela.

Ninguém ia sequer considerá-la,

porque ninguém tinha uma pista de que ela podia causar falha respiratória.

Porquê? Apenas senso comum. Não existe informação -

nenhuma informação que suporte se ela causa doenças moderadas ou severas.

Claramente, temos o caso de uma pessoa saudável que está a desfalecer.

É um caso de estudo.

Vou contar-vos uma última coisa nos últimos dois minutos

que ainda não foi publicada - vai ser divulgada amanhã -

e é um caso interessante de uma aplicação para este chip

para encontrar algo novo e abrir uma nova porta.

Cancro da próstata. Não necessito de vos dar muitas estatísticas

sobre o cancro da próstata. A maioria de vós já as sabe:

terceira causa de morte por cancro nos Estados Unidos.

Inúmeros factores de risco,

mas existe uma predisposição genética para o cancro da próstata.

Para cerca de 10% dos cancros da próstata,

há indivíduos que apresentam uma predisposição genética.

E o primeiro gene que foi mapeado em estudos de associação

para isto, cancro da próstata de ocorrência permatura, foi um gene designado RNASEL.

O que é? É uma enzima de defesa anti-vírica.

Então podemos pensar,

porque vão os indivíduos que têm a mutação,

uma deficiência no sistema de defesa anti-viral, contrair cancro da próstata?

Não faz sentido, a não ser que talvez haja um vírus.

Então, colocámos tumores - e temos agora mais de 100 tumores - no nosso chip.

E sabemos quem tem deficiências em RNASEL e quem não tem.

E estou a mostrar-vos o sinal provindo do chip aqui,

e estou a mostrá-lo para o bloco de oligos retrovirais.

E o que vos posso dizer sobre o sinal é que

homens com mutações neste sistema de defesa anti-viral,

e que têm um tumor, frequentemente têm - 40% das vezes -

uma assinatura que revela um novo retrovírus.

Isto é bastante misterioso. O que é?

Clonámos o vírus inteiro.

Antes de mais, vou-vos dizer que uma pequena predição automática precaveu-nos

que era bastante similar a um vírus de rato.

Mas isso não nos diz muito,

por isso acabámos por o clonar todo.

E o genoma viral que eu vos estou a mostrar aqui?

É um clássico gama retrovírus, mas é totalmente novo;

nínguem o houvera observado antes.

O seu relativo mais próximo é, de facto, de um rato,

e por isso podemos designá-lo como um retrovírus xenotrópico,

porque está a infectar outras espécies que não ratos.

E isto é uma pequena árvore filogenética

para vermos como está relacionado com outros vírus.

E agora já o fizémos para vários pacientes,

e podemos afirmar que são todos infecções independentes.

Todos eles têm o mesmo vírus,

mas eles são suficientemente distintos que existem razões para acreditar

que foram adquiridos de forma independente.

Estará realmente no tecido? E vou terminar com isto. Sim.

Nós tirámos amostras destas biopsias de tecido tumural

e usámos material para detectar a localização do vírus,

e encontrámos aqui células com partículas virais.

Estas pessoas têm de facto este vírus.

Causará este vírus cancro da próstata?

Nada do que eu disse aqui o implica enquanto causa. Não sei.

Será um factor que condicione oncogénese? Não sei.

Poderá ser o caso de estes indivíduos serem mais susceptíveis ao vírus?

Pode ser. E até pode não ter nada a ver com o cancro.

Mas agora é uma porta.

Temos uma forte associação entre a presença deste vírus

e a mutação genética que tem estado associada ao cancro.

É onde nós estamos.

Assim, tudo isto levanta mais questões que aquelas a que responde, receio,

mas é isso, como sabem, que a ciência é boa fazer.

Tudo isto foi feito por colegas no laboratório,

não posso tomar crédito pela maioria disto.

É fruto de uma colaboração entre mim e o Don.

Esta é a pessoa que iniciou o projecto no meu laboratório,

e esta é a que tem andado a investigar a próstata.

Muito obrigado a todos.