Resolução de mistérios médicos

O bioquímico Joe DeRisi fala sobre inovadoras formas de diagnosticar vírus (e tratar as doenças que causam) utilizando ADN. O seu trabalho pode ajudar a perceber a malária, a SARS, a gripe das aves e 60% das infeções virais diárias que escapam ao diagnóstico.

Como é que podemos investigar

esta diversidade de vírus que nos rodeiam
e ajudar a medicina?

Como podemos transformar
o nosso conhecimento acumulado de virologia

num instrumento de diagnóstico simples
que caiba numa mão?

Quero transformar tudo o que sabemos
neste momento sobre detetar vírus

e sobre o espetro de vírus
que por aí andam

num pequeno chip.

Quando começámos a pensar neste projeto,

como construir um instrumento
simples de diagnóstico

para analisar em simultâneo
todos os agentes patogénicos,

surgiram alguns problemas com esta ideia.

Em primeiro lugar,
os vírus são bastante complexos,

e também evoluem bastante depressa.

Isto é um picornavírus.

Os picornavírus incluem a constipação comum
e a poliomielite, coisas como estas.

Estamos a observar
a cápsula exterior do vírus.

Esta cor amarela aqui
são regiões do vírus

que evoluem muito rapidamente,

e as regiões azuis não
evoluem muito depressa.

Quando se tentam fazer reagentes
de deteção pan-viral,

geralmente o maior problema
decorre da evolução rápida,

porque como podemos detetar estruturas
se elas estão sempre a mudar?

Mas a evolução é um equilíbrio:

onde ocorrem mudanças rápidas,
também existe ultraconservação,

coisas que quase nunca mudam.

Então olhámos para isto
um pouco mais atentamente,

e vou mostrar-vos alguns dados.

Isto são coisas que podemos fazer
no computador.

Peguei nuns quantos destes
pequenos picornavírus,

como a constipação comum, a pólio, etc.,

e quebrei-os em pequenos segmentos.

Peguei neste primeiro exemplo,
que é chamado de coxsackievírus,

e parti-o em pequenas aberturas.

Estou a colorir essas pequenas
aberturas de azul

se outro vírus partilhar uma sequência
idêntica no seu genoma com a desse vírus.

Estas sequências aqui,

que, aliás, nem sequer
codificam proteínas,

são praticamente idêntica
entre todos estes,

então posso utilizar esta sequência
como um marcador

para detetar um vasto espetro de vírus,

sem ter que construir algo específico.

Ora bem, aqui existe grande diversidade:

é onde tudo evolui rapidamente.

Aqui em baixo, observamos
uma evolução mais lenta: menor diversidade.

Quando nós aqui chegarmos,

ao vírus da paralisia aguda das abelhas,

provavelmente um mau vírus
para as abelhas,

este vírus não partilha praticamente
nenhuma semelhança com o coxsackievírus,

mas posso garantir-vos que as sequências
que são mais conservadas

entre estes vírus no lado direito do ecrã

encontram-se em regiões idênticas aqui.

Então nós podemos encapsular
estas regiões de ultraconservação

através da evolução,
como estes vírus evoluíram,

escolhendo somente
elementos de ADN ou de ARN

nestas regiões para representar
no nosso chip como reagentes de deteção.

Foi isso que fizemos,
mas como fomos fazer isso?

Durante muito tempo,
desde que eu andava na faculdade,

tenho andado entretido
a construir chips de ADN,

isto é, a imprimir ADN em vidro.

E é isso que veem aqui, estas pequenas
manchas são apenas ADN impresso em vidro,

e eu posso colocar milhares
nos chips de vidro

e utilizá-las como reagentes de deteção.

Levámos o nosso chip à Hewlett-Packard

e usámos o microscópio de força atómica
num destes pontos,

e isto é o que é visível:

vemos as cadeias de ADN
estendidas sobre o vidro.

Então, estamos a imprimir ADN em vidro,

pequenas coisas achatadas,
que vai servir de marcador para patogénios.

Assim, construí pequenos robôs
no laboratório para montar os chips,

e sou um adepto
da disseminação da tecnologia.

Se têm dinheiro suficiente
para comprar uma Camry,

também podem construir isto.

Disponibilizamos um manual de instruções
completo na web, gratuitamente,

basicamente com a indicação
das peças a encomendar.

Podem construir uma máquina
de microarranjo de ADN na garagem.

Esta é a secção dos imprescindíveis
botões stop de emergência.

(Risos)

Qualquer máquina importante
tem de ter um grande botão vermelho.

Agora a sério, é bastante resistente.

Podem fazer chips de ADN na garagem,

e descodificar alguns programas genéticos
rapidamente.

É bastante divertido.

(Risos)

Este é um projeto muito interessante,

começámos por fazer
um chip de vírus respiratórios.

Já falei disto?

Uma situação em que
se dirigem a uma clínica

e não são diagnosticados?

Pusemos todos os vírus
respiratórios humanos num chip

e pusemos também o vírus
do herpes, por precaução, porque não?

A primeira coisa a fazer como cientistas é:
têm de se certificar que o teste funciona.

Então fizemos uma cultura de células,
infetámo-la com vários vírus,

pegámos na preparação e marcámos
por fluorescência o ácido nucleico,

o material genético que obtivemos
dessa cultura celular

— sobretudo material viral — e colocámo-lo
sobre o chip para ver onde hibridava.

Se as sequências de ADN corresponderem,
ficam unidas,

e depois podemos ir ver os pontos.

Se houver pontos fluorescentes,
existe ali um certo vírus.

Este é o aspeto de um desses chips.

Os pontos vermelhos são um sinal
proveniente do vírus.

Cada ponto representa uma família
ou uma espécie diferente de vírus.

Esta é uma forma complicada
de ver o resultado.

Vou codificar a informação
como um código de barras,

agrupado por famílias, para podermos
ver o resultado de forma mais intuitiva.

Pegámos em culturas de células de tecido
e infetámo-las com adenovírus.

Vemos este código de barras amarelo
próximo do adenovírus.

Do mesmo modo, infetámos
com parainfluenza-3 — um paramyxovírus.

Vemos um código de barras aqui.

Depois fizemos
o vírus sincicial respiratório.

É o flagelo dos centros de dia
por todo o lado

— é o "bicho papão".

(Risos)

Vemos que este código de barras
é da mesma família,

mas é distinto do parainfluenza-3,
que vos dá uma má constipação.

Assim obtemos assinaturas únicas,
uma impressão digital para cada vírus.

O pólio e o rino estão ambas
na mesma família, perto uma da outra.

Rino é a constipação comum.

Verificarmos que estas assinaturas
são diferentes.

O vírus do herpes associado
ao sarcoma de Kaposi

dá-nos aqui uma bela assinatura.

Não é uma risca qualquer ou assim

que me diz que tenho aqui um vírus
de um determinado tipo,

é o código de barras que, no seu todo,
representa essa informação.

Ok, eu posso ver um rinovírus

— e aqui está ampliado
do código de barras do rinovírus —

mas então e diferentes rinovírus?

Como sei que rinovírus tenho?

Há 102 variantes conhecidas
da constipação comum,

e são apenas 102 porque as pessoas
fartaram-se de os catalogar:

surgem novos todos os anos.

Aqui estão quatro rinovírus diferentes,

e vemos, até a olho nu,

sem qualquer programa
especial de reconhecimento

de padrões semelhantes
através de algoritmos,

que é possível distinguir
estes códigos de barras uns dos outros.

Este é uma espécie de exemplo base,

porque eu sei qual é a sequência
genética de todos estes rinovírus,

e desenhei o chip, propositadamente,
para poder diferenciá-los.

Mas então os rinovírus que nunca viram
um sequenciador genético?

Não sabemos qual é a sequência,
apenas os obtivemos.

Temos então quatro rinovírus
dos quais nunca soubemos nada,

nunca ninguém os sequenciou.

E vemos que obtêm
padrões únicos e distinguíveis.

Podemos imaginar a construção
de uma biblioteca, real ou virtual,

de impressões digitais de todos os vírus.

Mas isso é, de novo, caçar galinhas
na capoeira, percebem?

Temos tecidos em cultura celular:
há centenas de vírus.

E então com pessoas a sério?

Não podemos controlar pessoas a sério,
como devem saber.

Não fazemos ideia do que uma pessoa
vai tossir para um copo,

e é decerto muito complexo, não é?

Pode ter inúmeras bactérias,
mais do que um vírus,

certamente tem material
genético do hospedeiro,

como lidar com isso?

Como fazemos o controlo positivo
nesta situação?

É simples.

Aqui, estou a fazer uma lavagem nasal.

A ideia é, experimentalmente,
inocular pessoas com vírus.

A propósito tudo isto é aprovado
pelo comité de ética IRB, foram pagos.

E basicamente, experimentalmente
inoculámos pessoas

com o vírus da constipação comum.

Ou, melhor ainda, fomos diretamente
às urgências buscar pessoas

com infeções do trato respiratório,
adquiridas na comunidade e indefinidas.

Não fazemos ideia do que aparece.

Então, vamos começar primeiro
pelo controlo positivo,

onde sabemos que a pessoa
estava saudável.

Elas recebem uma dose de vírus pelo nariz,
vamos ver o que acontece.

Dia 0: nada acontece.

Estão saudáveis, estão limpas,
é fantástico.

Pensámos que o trato nasal
tivesse vírus, mesmo quando saudáveis.

Está bastante limpo.

Dia 2: surge um padrão
consistente com rinovírus,

muito semelhante ao obtido em laboratório

na experiência
com tecidos em cultura celular.

Fantástico, mas de novo,
um tiro fácil, não é?

Pusemos uma data de vírus no nariz dele,
queríamos que funcionasse.

(Risos)

Ele teve mesmo uma constipação.

E então com as pessoas apanhadas na rua?

Temos aqui dois indivíduos anónimos
representados por códigos.

Ambos têm rinovírus. Nunca vimos
este padrão no laboratório.

Sequenciámos partes dos seus vírus.

São rinovírus novos que nunca víramos.

As nossas sequências
evolucionárias conservadas

que usamos neste teste
permitem-nos detetar

vírus novos e não classificados,

porque escolhemos o que é conservado
durante a evolução.

Aqui está outro indivíduo.
Podem tentar aqui o vosso diagnóstico.

Estes diferentes blocos representam
os diferentes vírus

na família do paramixovírus.

Podem percorrer os blocos
e ver onde está o sinal.

Não tem cinomose canina,
o que é bom sinal.

(Risos)

Mas quando chegarem ao bloco nove,
encontram o vírus sincicial respiratório.

Talvez tenham filhos.

Vemos também
o membro familiar relacionado:

o vírus sincicial respiratório
aparece aqui.

Este é outro indivíduo.
Recolhemos amostras em dois dias distintos

— visitas repetidas à clínica.

Este indivíduo tem parainfluenza-1,

e verificamos que há aqui
uma pequena risca

para o vírus Sendai:
a parainfluenza dos ratos.

As relações genéticas são muito próximas.
É muito interessante.

Então, nós construímos o chip.

Criámos um chip
com todos os vírus conhecidos.

Porque não? Todos os vírus das plantas,
dos insetos, os vírus marinhos.

Tudo o que conseguimos
descobrir no GenBank,

ou seja, no repositório
nacional de sequências.

Atualmente estamos a utilizar este chip.
E para quê?

Primeiro, quando há
um grande chip como este,

é preciso mais informática.

Desenhámos um sistema
para automatizar o diagnóstico.

A ideia é termos padrões virtuais,

porque nunca vamos conseguir
arranjar amostras de todos os vírus.

Seria impossível, mas podemos ter
padrões virtuais,

e compará-los com o resultado observado,

que é uma mistura complexa
e nos fornece uma espécie de pontuação

sobre quão provável é
isto ser um rinovírus ou algo do género.

E é com isto que se parece.

Se, por exemplo,
usámos uma cultura celular

que está cronicamente infetada
com papiloma

recebemos uma notificação do computador,

e o nosso algoritmo diz
que é provavelmente papiloma tipo 18.

De facto, é com o que
estas culturas celulares, em particular,

estão cronicamente infetadas.

Vamos fazer algo um pouco mais complicado.

Pusemos o beeper na clínica.

Quando alguém surge
e o hospital não sabe o que fazer

não o conseguem diagnosticar,
contactam-nos.

Estamos a implementar isto na Bay Area.

Este caso foi-nos reportado
há três semanas.

Temos uma mulher de 28 anos saudável,
sem historial de viagens,

não fuma, não bebe.

Com febre há 10 dias,
suores noturnos, sangue na expetoração

— tem tossido sangue —
dores musculares.

Dirigiu-se à clínica,
deram-lhe antibióticos

e mandaram-na para casa.

Voltou após 10 dias de febre,
ainda tem febre e está hipóxica

— não tem muito oxigénio nos pulmões.

Fizeram uma TAC.

Um pulmão normal é, por regra,
escuro e preto aqui.

Esta coloração branca, não é boa.

Esta espécie de árvore e vesículas
indica que existe inflamação,

é provável que exista uma infeção.

Então, a doente foi depois tratada

com um antibiótico cefalosporina
de terceira geração e doxiciclina.

No terceiro dia, sem se resolver:
ela progrediu para falha aguda.

Tiveram que entubá-la,
colocaram-lhe um tubo na garganta

e começaram a ventilá-la mecanicamente.

Não conseguia respirar autonomamente.

O que fazer a seguir? Não se sabe.

Mudaram-lhe os antibióticos. Tamiflu.

Não é claro porque é que pensaram
que ela tinha gripe

mas administraram-lhe Tamiflu.

Ao sexto dia, desistiram.

Só se faz uma biópsia de pulmões abertos
quando não há alternativa.

Há uma mortalidade de 8%
associada a este procedimento,

e o que é que se aprende com isso?

Estão a olhar para a biópsia
de pulmão aberto.

Não se pode dizer muito a partir disto.

Só podemos dizer que há
uma grande inflamação: bronquiolite.

Inconclusivo.
Foi o relatório do patologista.

Então, a que é que a testaram?

Eles tinham os seus testes, claro.

Testaram-na para mais
de 70 ensaios diferentes,

para todos os tipos de bactérias
e fungos e vírus

cujos ensaios se podem encomendar:

SARS, metapneumovírus,
VIH, RSV — isso tudo.

Todos deram negativos. Testes no valor
de mais de 100 000 dólares.

Isto é, foram aos limites por esta mulher.

Só ao oitavo dia de internamento
é que nos contactaram.

Forneceram-nos um aspirado endotraqueal

ou seja, um pouco de fluido da garganta,

do tubo que lá inseriram.

Pusemo-lo no chip; o que vemos?
Vemos parainfluenza-4.

Mas, que diabo é parainfluenza-4?

Ninguém faz testes para parainfluenza-4.
Ninguém lhe liga nenhuma.

Nem sequer é sequenciada frequentemente.

Só há uma porção sequenciada.

Quase não existe epidemiologia
ou estudos sobre ela.

Ninguém ia sequer considerá-la,

porque ninguém sabia
que ela podia causar falha respiratória.

Porquê? Apenas senso comum.

Não há informação que indique
se ela causa doenças moderadas ou graves.

Temos o caso de uma pessoa saudável
que está a desfalecer.

É um caso de estudo.

Vou contar uma última coisa
nos últimos dois minutos

que ainda não foi publicada
— vai ser divulgada amanhã.

É um caso interessante
de uma aplicação para este chip

para encontrar algo novo
e abrir uma nova porta.

Cancro da próstata.

Não necessito de dar muitas estatísticas
sobre o cancro da próstata.

São conhecidas: terceira causa de morte
por cancro nos EUA.

Inúmeros fatores de risco,

mas há uma predisposição genética
para o cancro da próstata.

Em cerca de 10% dos cancros da próstata,

há indivíduos que apresentam
uma predisposição genética.

E o primeiro gene que foi mapeado
em estudos de associação,

para cancro da próstata de ocorrência
prematura, foi um gene designado RNASEL.

O que é? É uma enzima
de defesa antivírica.

Então podemos pensar:

porque é que os indivíduos
que têm a mutação,

uma deficiência no sistema de defesa
antiviral, vão contrair este cancro?

Não faz sentido, a não ser
que talvez haja um vírus.

Então, colocámos tumores no nosso chip
— e temos agora mais de 100 tumores.

Sabemos quem tem deficiências
em RNASEL e quem não tem.

Estou a mostrar aqui
o sinal proveniente do chip,

e estou a mostrá-lo para o bloco
de oligorretrovirais.

O que vos posso dizer sobre o sinal é que

homens com mutações
neste sistema de defesa antiviral,

e que têm um tumor, frequentemente têm
— 40% das vezes —

uma assinatura que revela
um novo retrovírus.

Isto é bastante misterioso. O que é?

Clonámos o vírus inteiro.

Antes de mais, informo
que uma previsão automática avisou-nos

que era bastante semelhante
a um vírus de rato.

Mas isso não nos diz muito,
por isso acabámos por o clonar todo.

O genoma viral que eu estou a mostrar aqui

é um clássico gama retrovírus,
mas é totalmente novo;

nunca ninguém o tinha observado.

O seu parente mais próximo
é, de facto, de um rato.

Por isso podemos designá-lo
como um retrovírus xenotrópico,

porque está a infetar outras espécies
que não os ratos.

Isto é uma pequena árvore filogenética

para vermos como está relacionado
com outros vírus.

Já o fizemos para muitos doentes

e podemos afirmar que são todos
infeções independentes.

Todos eles têm o mesmo vírus,

mas são suficientemente distintos
para acreditarmos

que foram adquiridos
de forma independente.

Estará realmente no tecido? Sim.

Tirámos amostras destas biópsias
de tecido tumoral

e usámos material para detetar
a localização do vírus,

e encontrámos aqui células
com partículas virais.

Estas pessoas têm de facto este vírus.

Causará este vírus cancro da próstata?

Nada do que eu disse aqui
o implica enquanto causa. Não sei.

Será um fator
que condicione oncogénese? Não sei.

Dar-se-á o caso de estes indivíduos
serem mais suscetíveis ao vírus?

Pode ser. E até pode não ter nada
a ver com o cancro.

Mas agora é uma porta.

Temos uma forte associação
entre a presença deste vírus

e a mutação genética
que tem estado associada ao cancro.

É onde nós estamos.

Tudo isto levanta mais perguntas
do que respostas.

Mas, como sabem,
é nisso que a ciência é boa.

Foi tudo feito por colegas no laboratório,

não é mérito só meu, é fruto
da colaboração entre mim e o Don.

Este iniciou o projeto
no meu laboratório,

e este tem andado a investigar a próstata.

Muito obrigado a todos.