Joe DeRisi rozwiązuje medyczne zagadki za pomocą ViroScan

Biochemik Joe DeRisi opowiada o nowych zadziwiających sposobach diagnozowania wirusów (i leczenia chorób przez nie powodowanych) poprzez DNA. Jego osiągnięcia być może pomogą zrozumieć malarię, SARS, ptasią grypę -- oraz te 60 procent infekcji wirusowych, które nie są dziś diagnozowane.

Jak możemy zbadać

wirusową florę, która nas otacza i pomóc medycynie?

Jak możemy przekształcić całą naszą wiedzę o wirusach

w pojedynczy, prosty i poręczny test diagnostyczny?

Chcę przekształcić wszystko, co wiemy obecnie o wykrywaniu wirusów

i o całym spektrum istniejących wirusów,

w, powiedzmy, niewielki chip.

Kiedy zaczęliśmy myśleć nad tym projektem --

jak można zrobić pojedynczy test diagnostyczny

do przebadania wszystkich patogenów jednocześnie,

nasunęło się kilka problemów.

Po pierwsze, wirusy są dosyć złożone,

a do tego bardzo szybko ewoluują.

To jest pikornawirus.

Pikornawirusy powodują między innymi

przeziębienia, polio i inne choroby.

Patrzycie teraz na zewnętrzną otoczkę wirusa,

w żółtym kolorze pokazane są te części wirusa

które ewoluują niezmiernie szybko,

a na niebiesko te, które ewoluują wolniej.

Gdy myśli się o stworzeniu środka wykrywającego wszelkie wirusy,

zwykle ta szybkość ewolucji jest problemem,

bo jak wykryć coś, co bez przerwy się zmienia?

Ale ewolucja to równowaga:

tam, gdzie są szybkie zmiany, tam jest też niezmienność --

rzeczy, które prawie nigdy się nie zmieniają.

Przyjrzeliśmy się temu dokładniej

i teraz pokażę wam dane.

Takie rzeczy można zrobić na zwykłym komputerze.

Wziąłem grupę tych małych pikornawirusów,

tych od przeziębienia, polio i tak dalej,

i rozbiłem je na małe segmenty,

na przykład ten pierwszy, zwany wirusem coxsackie,

i rozbiłem go na małe okienka.

Okienka koloruję na niebiesko,

jeśli genom innego wirusa zawiera taką samą sekwencję,

jak ten wirus.

Te sekwencje tutaj --

które, nawiasem mówiąc, nawet nie kodują białek --

są prawie zupełnie identyczne we wszystkich tych wirusach,

więc mogę użyć tej sekwencji jako znacznika

do wykrywania szerokiego spektrum wirusów,

bez potrzeby oznaczania każdego indywidualnie.

Za to tutaj widać wielką różnorodność:

w tym miejscu zmieniają się szybko.

Tutaj widać wolniejszą ewolucję i mniej zróżnicowania.

Ale zanim dojdziemy tutaj do, powiedzmy,

wirusa ostrego paraliżu pszczół --

pewnie groźny, jeśli jest się pszczołą --

ten wirus wykazuje znikome podobieństwo do wirusa coxsackie,

ale zapewniam was, że sekwencje najmniej zmienne

wśród wirusów po prawej stronie ekranu

znajdują się w tych samych regionach tutaj.

Możemy wyszczególnić te regiony,

które pozostały niezmienne w trakcie ewolucji wirusów,

wybierając po prostu fragmenty DNA lub RNA

z tych regionów, by służyły jako detektory na naszym chipie.

OK, to właśnie zrobiliśmy, ale w jaki sposób?

Od dłuższego czasu, od ostatnich lat studiów,

bawiłem się w robienie chipów DNA,

czyli nadrukowywanie DNA na szkle.

To właśnie widzicie tutaj:

te plamki soli to DNA przytwierdzone do szkła,

w ten sposób można nanieść ich tysiące na szklany chip

i użyć ich jako detektorów.

Zabraliśmy nasz chip do Hewlett-Packard

i zbadaliśmy jedną z takich kropek

pod ich mikroskopem sił atomowych -- i oto, co widać:

można rzeczywiście zobaczyć nici DNA leżące na szkle.

To, co robimy, to drukowanie DNA na szkle --

te małe płaskie nitki -- i to będą znaczniki patogenów.

W laboratorium konstruuję małe roboty do robienia chipów

i jestem naprawdę niezły w rozprowadzaniu technologii.

Jeśli macie tyle pieniędzy, żeby kupić Camry,

też możecie zbudować takiego robota,

umieściliśmy w sieci szczegółową instrukcję, zupełnie darmową,

ze wszystkimi dostępnymi częściami --

można zbudować taką maszynę do chipów DNA w garażu.

Ta część instrukcji jest o najważniejszym wyłączniku awaryjnym.

(śmiech)

Każda poważna maszyna musi mieć duży czerwony guzik.

Ale tak naprawdę to całkiem solidne i nieskomplikowane.

Można produkować chipy DNA w garażu

i odczytywać informacje genetyczne całkiem szybko. To niezła zabawa.

(śmiech)

Oto, co zrobiliśmy -- to naprawdę fajny projekt --

zaczęliśmy od chipa do diagnozowania

wirusów chorób dróg oddechowych. Mówiłem o tym --

wiecie, o sytuacji, kiedy idziecie do przychodni

i nie mogą postawić wam diagnozy?

Więc po prostu umieściliśmy wszystkie wirusy zakażające drogi oddechowe

na jednym chipie i dorzuciliśmy wirusa opryszczki dla kontroli --

czemu nie?

Pierwszą rzeczą, jaką naukowiec robi

jest upewnienie się, że wszystko działa.

My wzięliśmy komórki z hodowli tkankowych

i zaraziliśmy je różnymi wirusami,

potem wyznakowaliśmy fluorescencyjnie kwasy nukleinowe,

czyli materiał genetyczny otrzymany z tych komórek --

głównie wirusowy -- i nanieśliśmy na chip, żeby zobaczyć, gdzie się przyczepi.

Jeśli sekwencje DNA pasują do siebie, przyczepiają się

i możemy przyjrzeć się kropkom.

Jeśli kropki się zaświecą, wiemy, że jest tam konkretny wirus.

Tak wygląda jeden z takich chipów,

te czerwone kropki sygnalizują obecność wirusa.

Każda kropka reprezentuje inną rodzinę

lub gatunek wirusa.

Jednak w ten sposób trudno jest coś zobaczyć,

więc przedstawię to jako mały kod kreskowy, pogrupowany rodzinami,

żeby można było odczytać wyniki w bardzo intuicyjny sposób.

Wzięliśmy komórki z hodowli tkankowej

i zaraziliśmy je adenowirusem,

tu widać mały żółty kod kreskowy obok adenowirusa.

Podobnie zaraziliśmy wirusem paragrypy typu 3 --

to jest paramyksowirus -- i tu jest mały kod kreskowy.

Potem to samo zrobiliśmy z wirusem RSV.

To prawdziwa plaga wszystkich przedszkoli,

jedno wielkie smarkowisko.

(śmiech)

Widzicie, że ten kod kreskowy to ta sama rodzina,

ale różni się od wirusa paragrypy typu 3,

powodującego ciężkie przeziębienie.

W ten sposób otrzymujemy unikalne sygnatury, " odcisk palca" każdego wirusa.

Polio i rinowirus: są w tej samej rodzinie, bardzo do siebie podobne.

Rino to przeziębienie, czym jest polio, wszyscy wiecie,

i jak widać, ich sygnatury są różne.

Wirus opryszczki mięsaka Kaposiego (KSHV)

daje tutaj bardzo ładny ślad.

To nie jest jakiś pojedynczy pasek,

który mówi, że mamy tu wirusa konkretnego typu;

to kod kreskowy w całości przedstawia wszystko.

OK; widzę tu rinowirusa --

tutaj jest powiększenie jego kodu kreskowego --

ale co z różnymi odmianami rinowirusa?

Skąd mam wiedzieć, którego rinowirusa mam?

Znane są 102 warianty przeziębienia,

a jest ich tylko 102, bo ludziom znudziło się je kolekcjonować:

co roku pojawiają się nowe.

Tu są cztery różne rinowirusy

i gołym okiem można zobaczyć,

bez wymyślnych programów komputerowych

z algorytmami rozpoznającymi wzory,

że można odróżnić każdy z tych kodów od innych.

No tak, to jest w zasadzie tani chwyt,

bo znam sekwencje genetyczne wszystkich tych rinowirusów

i właściwie to ja zaprojektowałem ten chip tak,

żeby dało się je odróżnić,

ale co z rinowirusami, które nigdy nie widziały sekwenatora genetycznego?

Nie znamy ich sekwencji; po prostu bierzemy je ze środowiska.

Tu są cztery rinowirusy,

o których nic nie wiedzieliśmy --

nikt ich nie zsekwencjonował -- i także widać,

że można otrzymać niepowtarzalne i rozróżnialne wzory.

Można wyobrazić sobie stworzenie bilioteki, prawdziwej bądź wirtualnej,

"odcisków palca" praktycznie każdego wirusa.

Ale to znowu, no wiecie -- bułka z masłem.

W komórkach z hodowli tkankowych są tony wirusów.

A co z prawdziwymi ludźmi?

Jak wiecie, nie da się kontrolować ludzi.

Nie wiadomo, co ktoś może nakaszleć do kubeczka

i pewnie jest to bardzo złożone, prawda?

Może zawierać mnóstwo bakterii albo więcej niż jednego wirusa

i z pewnością zawiera materiał genetyczny gospodarza,

więc jak się za to zabrać?

I czego użyć jako pozytywnej kontroli?

To całkiem proste.

To ja w trakcie płukania nosa.

Pomysł polega na tym, żeby eksperymentalnie zarazić ludzi wirusem

-- to wszystko zatwierdziła komisja etyczna, płaci im się za to.

Więc eksperymentalnie zarażamy ludzi

wirusem przeziębienia.

Czy też jeszcze lepiej, weźmy ludzi

prosto z poczekalni lekarskiej --

nieokreślone, nabyte w społeczności infekcje dróg oddechowych.

Nie wiadomo, co się pojawi.

Zacznijmy od pozytywnej kontroli,

gdzie wiemy, że ta osoba była zdrowa.

Dostała dawkę wirusa do nosa,

zobaczmy, co się dzieje.

Dzień zero: nic się nie dzieje.

Badane osoby są zdrowe, wolne od wirusów - to zadziwiające.

Myśleliśmy, że kanał nosowy jest pełen wirusów

nawet u zdrowej osoby.

Tak naprawdę jest czysty. Jeśli jesteś zdrowy, to jesteś zdrowy i tyle.

Dzień drugi: otrzymaliśmy wyraźny wzór rinowirusa,

bardzo podobny do tego, co otrzymujemy w laboratorium

podczas doświadczeń na hodowlach tkankowych.

Wszystko pięknie, ale to znowu tani chwyt, nie?

Wprowadziliśmy człowiekowi tonę wirusa do nosa.

(śmiech)

To znaczy, chcieliśmy, żeby to zadziałało. On naprawdę był przeziębiony.

A co z ludźmi przychodzącymi z ulicy?

Tutaj są dwie osoby oznaczone anonimowymi numerami identyfikacyjnymi.

Obie mają rinowirusy; nigdy nie widzieliśmy takiego wzoru w laboratorium.

Zsekwencjonowaliśmy fragmenty tych wirusów;

to nowe rinowirusy, których jeszcze nikt dotychczas nie widział.

Przypominam, że te ewolucyjnie niezmienne sekwencje,

których używamy na naszej matrycy,

pozwalają wykryć również nowe, nieopisane wirusy,

bo wybieramy to, co jest niezmienne w trakcie ewolucji.

Tu jest następny przeziębiony, możecie sami pobawić się w diagnozę.

Te słupki reprezentują

różne wirusy z rodziny paramyksowirusów,

więc trzeba przesuwać się wzdłuż tych słupków

i sprawdzić, gdzie jest sygnał.

No tak, nie ma nosówki; to raczej dobrze.

(śmiech)

Ale gdy dochodzi się do dziewiątego słupka

widać wirusa RSV.

Być może mają dzieci. Dalej widać też

spokrewnionego członka rodziny: RSV-B tu się pokazuje.

No i świetnie.

Tu kolejna osoba: pobierano próbki w dwa różne dni

przy kolejnych wizytach w przychodni.

Ta osoba ma wirus paragrypy typu 1

i widzicie tu mały prążek

dla wirusa Sendai, to jest mysia paragrypa.

Pokrewieństwo genetyczne jest tu bardzo bliskie. To niezła zabawa.

Skonstruowaliśmy więc chip.

Zrobiliśmy chip, który zawiera każdego kiedykolwiek odkrytego wirusa.

Dlaczego nie? Każdego wirusa roślinnego, owadziego, morskiego.

Wszystko, co dało się znaleźć w GenBanku,

czyli w narodowym banku sekwencji.

Teraz używamy tego chipa. Do czego?

Po pierwsze, gdy się ma tak duży chip,

potrzeba trochę więcej informatyki,

więc zaprojektowaliśmy system tak, by dokonywał automatycznej diagnozy.

Chodzi o to, że mamy wirtualne wzory --

ponieważ nigdy nie uda się zebrać próbek każdego wirusa,

to praktycznie niemożliwe. Ale możemy wziąć wirtualne wzory

i porównać je do zaobserwowanego wyniku,

który jest bardzo złożoną mieszaniną; i dojść do jakiejś wartości

która określi prawdopodobieństwo, że to rinowirus albo coś innego.

A oto jak to wygląda.

Jeśli na przykład użyliśmy hodowli komórkowej

chronicznie zainfekowanej wirusem brodawczaka,

otrzymujemy odczyt komputerowy

i nasz algorytm mówi, że to prawdopodobnie wirus brodawczaka typu 18.

I rzeczywiście, to właśnie tym wirusem

są zarażone nasze badane komórki.

Zróbmy więc coś trudniejszego.

Umieściliśmy pager w klinice.

Gdy pojawi się ktoś, z kim szpital nie wie, co zrobić,

bo nie umieją postawić diagnozy, wzywają nas.

Taki jest pomysł, teraz uruchamiamy go w aglomeracji San Francisco.

To jest przypadek sprzed trzech tygodni.

Mamy 28-letnią zdrową kobietę, nie podróżowała,

nie pali, nie pije.

Od 10 dni gorączkuje, ma nocne poty, krwawą flegmę --

-- kaszle krwią -- ma bóle mięśniowe.

Przyszła do kliniki, dali jej antybiotyki

i posłali do domu.

Wróciła po dziesięciu dniach gorączki, tak -- ciągle gorączkuje --

i do tego hypoksja -- nie ma wystarczająco dużo tlenu w płucach.

Zrobili tomografię komputerową.

Normalne płuco to wszystko, co tu jest ciemne i czarne.

To wszystko białe -- nic dobrego.

Ta struktura przypominająca drzewo i pączki wskazuje na stan zapalny;

prawdopodobnie jest tam zakażenie.

OK. Pacjentka była dalej leczona

antybiotykiem cefalosporynowym trzeciej generacji oraz doksycykliną

i na trzeci dzień, nie pomogło: rozwinęła się niewydolność oddechowa.

Musieli ją intubować, więc włożyli jej rurkę przez gardło

i zaczęli mechanicznie ją wentylować.

Nie mogła już samodzielnie oddychać.

Co dalej? Nie wiadomo.

Zmienić antybiotyki, więc podali jej inny antybiotyk

i Tamiflu, które --

-- nie jest jasne, czemu myśleli, że ma grypę --

ale zaczęli podawać jej Tamiflu.

Szóstego dnia poddali się.

Biopsję na otwartym płucu robi się tylko wtedy, gdy nie ma już wyjścia.

Samo wykonanie tej procedury wiąże się z 8% śmiertelnością.

I czego się dowiadują?

Tu widzicie biopsję jej płuca.

Nie jestem patologiem, ale z tego nie da się wiele wywnioskować.

Jedno, co da się stwierdzić, to obrzęk: zapalenie oskrzelików.

Raport patologa brzmiał: nierozstrzygające.

Na co ją zbadali?

Oczywiście mają tam własne testy,

więc przeprowadzili ponad 70 różnych badań,

na przeróżne bakterie, grzyby i wirusy,

testy, które można kupić gotowe:

SARS, metapneumowirus, HIV, RSV -- wszystkie takie.

I wszystkie negatywne. Testy warte ponad 100 tysięcy dolarów.

Zrobili dla niej wszystko, naprawdę.

I ósmego dnia zadzwonili do nas.

Dali nam próbkę aspiratu tchawiczego --

no wiecie, trochę płynu z gardła,

z tej rurki, którą tam włożyli -- to nam dali.

Wrzuciliśmy to na chip: co widać? Zobaczyliśmy wirusa paragrypy typu 4.

Czym, do diabła, jest wirus paragrypy typu 4?

Nikt nie bada na wirusa paragrypy typu 4. Nikogo to nie obchodzi.

Właściwie nawet nie jest w całości zsekwencjonowany.

Zsekwencjonowano zaledwie mały fragment.

Prawie nie ma badań epidemiologicznych o nim.

Nikt by o nim nawet nie pomyślał,

bo nikt nie miał pojęcia, że może wywołać niewydolność oddechową.

Dlaczego tak jest? Tylko przekaz ustny, żadnych danych --

brak danych stwierdzających, czy powoduje ostrą, czy łagodną chorobę.

Mieliśmy przypadek zdrowej osoby, nagle umierającej.

OK, to jeden przypadek.

W ostatnie dwie minuty powiem jeszcze o jednej rzeczy --

-- to nieopublikowane, pojawi się to jutro --

to interesujący przykład jak można wykorzystać ten chip,

by znaleźć coś nowego i otworzyć nowe drzwi.

Rak prostaty, nie muszę podawać wielu statystyk

o raku prostaty. Większość z was już wie,

że to trzecia przyczyna śmierci na raka w USA.

Wiele czynników ryzyka,

ale jest też genetyczna predyspozycja do raka prostaty.

W przypadku raka prostaty około 10%

to ludzie z predyspozycjami do niego.

Pierwszy gen, jaki zlokalizowano w badaniach genetycznych

odpowiedzialny za wczesnego raka prostaty to gen nazywany RNASEL

Co to takiego? To enzym obrony przeciwwirusowej.

Więc siedzieliśmy i dumaliśmy,

dlaczego mężczyźni, którzy mają mutację,

defekt w systemie obrony przeciw wirusom, dostają raka?

To nie ma sensu -- o ile, być może, jest jakiś wirus.

Umieściliśmy więc guzy - mamy teraz ponad 100 guzów - na naszym teście.

I wiedzieliśmy kto ma defekty w RNASEL a kto nie.

Teraz pokazuję wam sygnał z chipa,

a tu wskazuję na blok retrowirusowach oligonukleotydów.

Co mogę powiedzieć na temat tego sygnału to to,

że mężczyźni z mutacją w enzymie broniącym przed wirusami,

którzy mają guza, często mają -- 40% przypadków --

ślad wskazujący na nowego retrowirusa.

OK, to niesamowite. Co to jest?

Sklonowaliśmy całego wirusa.

Po pierwsze: powiem wam, że automatyczne przewidywanie wykazało,

że jest bardzo podobny do mysiego wirusa.

To nie mówi nam wiele,

więc sklonowaliśmy całość.

A wirusowy genom, który pokazuję tutaj?

To klasyczny retrowirus typu gamma, ale całkowicie nowy.

Nikt go wcześniej nie widział.

Jego najbliższy krewniak pochodzi z myszy

więc możemy to nazwać ksenotropicznym retrowirusem,

bo zakaża gatunki inne niż myszy.

A to jest małe drzewo filogenetyczne,

by pokazać, jak jest spokrewniony z innymi wirusami.

Zrobiliśmy to u wielu pacjentów

i możemy powiedzieć, że to wszystko niezależne infekcje.

Wszyscy mają tego samego wirusa,

ale różni się na tyle, by sądzić,

że zostały nabyte niezależnie.

Czy jest naprawdę w tkance? Zakończę na tym: Tak.

Bierzemy wycinek tkanki z biopsji guza

i wykorzystujemy materiał, by zlokalizować wirusa,

i znajdujemy komórki zawierające cząstki wirusa.

Ci ludzie naprawdę mają tego wirusa.

Czy ten wirus powoduje raka prostaty?

Nic z tego, co tu mówię nie sugeruje przyczynowości. Nie wiem.

Czy łączy się z onkogenezą? Nie wiem.

Czy to przez to, że ci ludzie są po prostu wrażliwsi na wirusy?

Być może. I może to też nie mieć nic wspólnego z rakiem.

Ale są to drzwi.

Mamy silną asocjację pomiędzy obecnością wirusa

a genetyczną mutacją łączoną z rakiem.

To jest to, na czym stoimy.

Obawiam się, że to przynosi nam więcej pytań niż odpowiedzi,

ale to właśnie to, w czym nauka jest naprawdę dobra.

To wszystko zostało zrobione przez ludzi z laboratorium;

większość z tego nie jest moją zasługą.

To współpraca między mna i Donem.

Oto człowiek, który rozpoczął ten projekt w moim laboratorium,

a ten zrobił pracę na prostacie.

Dziękuję bardzo.