(French translation by Samuel Scherber) La réaction en chaîne par polymérase ou 'PCR' permet de cibler et amplifier n'importe acide nucléique spécifique des
échantillons biologiques complexes.
La procédure peut être utilisée pour le diagnostic afin de déterminer s'il y a
une séquence nucléaire spécifique à un certain pathogène dans un échantillon clinique.
Les chercheurs peut également utiliser la PCR pour amplifier et colorer de grandes quantités
d'un gène particulier pour la recherche.
Afin d'effectuer la PCR, il faut auparavant connaître la séquence de l'acide nucléique que vous souhaitez amplifier.
Ensuite, vous définissez les limites de la séquence cible en identifiant des courtes séquences situées à
chaque extrémité sur des brins opposés.
Ici, les limites de la séquence cible sont indiqués par la coloration violette et verte.
Si on parcourt ces séquences dans le sens de cinq prime vers trois prime, qui est dans le même sens
de la synthèse de l'ADN naturel, l'élongation marquée par la violette s'allonge le long d'un brin et l'élongation marquée par le vert
s'allonge le long du brin complémentaire.
Puisqu'il est difficile de montrer comment fonctionne la PCR en utilisant cette représentation double hélice de l'ADN,
on vous montre un diagramme de l'ADN en approximation d'une échelle, qui est plus facile à comprendre.
En plus de l'échantillon clinique, la réaction de PCR nécessite trois autres ingrédients.
Tout d'abord, il faut y avoir un apport massif de chacun des quatre nucléotides.
Deuxièmement, l'utilisateur doit ajouter une grande quantité de petites amorces synthétiques choisies
pour s'hybrider à la séquence située à chaque extrémité de l'ADN cible.
Les amorces sont les ingrédients qui rendent la réaction spécifique car seulement l'ADN qui
se situe entre ces deux amorces seront synthétisées dans la réaction PCR.
Troisièmement, la réaction nécessite l'enzyme ADN polymérase.
Pour la PCR, la polymérase est en fait d'origine d'une bactérie qui se développe normalement dans la mer à proximité
des chaudes cheminées hydrothermales sur le plancher océanique.
La bactérie s'appelle 'Thermus aquaticus' et donc la polymérase s'appelle 'Taq polymérase'
tout simplement.
Cette enzyme exotique est utilisée car il n'est pas inactivée par les hautes températures générées
pendant la réaction PCR.
Tous ces acteurs sont introduits dans des proportions correctes dans le même tube et sont mélangés. Puis, on place le tube dans un appareil que l'on appelle
un thermocycleur.
Cet instrument peut être programmé pour modifier la température du mélange à travers une série
des cycles répétitifs.
On peut voir, dans la partie inférieure droite de l'écran, la température de la réaction durant cette démonstration.
Dans le premier cycle de PCR, la température est élevée jusqu'au point où l'ADN se dénature
et les brins complémentaires se séparent.
La température est ensuite abaissée à un niveau suffisant pour que les brins complémentaires puissent se réassocier.
Cependant, étant donné que les amorces sont présents en très grand excès dans le mélange, ils
s'hybrideront probablement aux sites complémentaires lorsque les brins se réassocier.
Pendant que la température est davantage abaissée, la polymérase retrouve les extrémités libres des
amorces et l'enzyme commence à ajouter des nucléotides à l'extrémité de l'amorce en utilisant le
brin complémentaire comme matrice.
On voit le même processus dans la réplication de l'ADN pendant la division cellulaire normale.
À la fin de la première cycle de PCR, on aura deux copies de la séquence cible pour
chacune qui était présente dans l'échantillon clinique original.
Vous pouvez suivre les produits de l'amplification dans le panneau qui s'affiche en bas et à gauche de l'écran.
Le même processus se déroule pendant le second cycle de PCR.
Le theromcycleur réchauffe considérablement l'échantillon pour que les brins d'ADN complémentaires puissent se séparer,
y compris ceux qui viennent d'être synthétisés.
Ensuite, la température est abaissée afin de permettre les amorces à se lier à leur sites spécifiques et promouvoir
la synthèse de brins complémentaires par la Taq polymérase, lorsque la température est davantage et
de nouveau abaissée
Au troisième tour, la même cyclisation de la température de réaction se produit avec la dénaturation des
brins, l'hybridisation des amorces lorsque la température est abaissée, et la synthèse du brin nouveau lorsque
les brins sont prêts pour que l'ADN polymérase puisse commencer à ajouter des nucléotides.
A la fin du troisième tour il y a maintenant huit copies doubles brins de la séquence cible
où il en était à l'origine une seule.
En regardant le diagramme aggrandissant du coin inférieur gauche de l'écran, on peut voir ce qui se passera avec des cycles successifs
de PCR.
Après chaque cycle, on double le nombre de copies de la séquence cible; donc il y aura seize
copies après quatre cycles, 32 copies après cinq cycles, et 64 copies d'après
six cycles.
Au moment où le thermocycleur a fini 40 cycles, les amorces et les nucléotides seront
probablement épuisés, mais il en théorie, on aura théoriquement dix à la douzième (10 ^ 12) copies.
La séquence cible aura été amplifié un trillion de fois.
Ce niveau d'amplification suffit à produire une quantité de l'ADN spécifique que l'on peut en visualiser
par l'électrophorèse sur gel.
La tache de l'ADN en haut du gel représente tout l'ADN qui était présent
dans l'échantillon clinique.
Notons cependant qu'il y des nouvelle taches plus petite dans les échantillons prélevés pendant les derniers cycles de PCR.
À des fins de diagnostic en laboratoire, l'ADN amplifié peut être détecté et quantifié en utilisant des
méthodes plus efficaces et plus simples que l'électrophorèse sur gel.
On discute une de ces méthodes dans un programme d'accompagnement.