WEBVTT 00:00:02.095 --> 00:00:10.058 (French translation by Samuel Scherber) La réaction en chaîne par polymérase ou 'PCR' permet de cibler et amplifier n'importe acide nucléique spécifique des 00:00:10.058 --> 00:00:13.004 échantillons biologiques complexes. 00:00:13.004 --> 00:00:18.051 La procédure peut être utilisée pour le diagnostic afin de déterminer s'il y a 00:00:18.051 --> 00:00:23.047 une séquence nucléaire spécifique à un certain pathogène dans un échantillon clinique. 00:00:23.047 --> 00:00:31.005 Les chercheurs peut également utiliser la PCR pour amplifier et colorer de grandes quantités 00:00:31.005 --> 00:00:34.046 d'un gène particulier pour la recherche. 00:00:34.046 --> 00:00:39.091 Afin d'effectuer la PCR, il faut auparavant connaître la séquence de l'acide nucléique que vous souhaitez amplifier. 00:00:39.091 --> 00:00:45.072 Ensuite, vous définissez les limites de la séquence cible en identifiant des courtes séquences situées à 00:00:45.072 --> 00:00:48.019 chaque extrémité sur des brins opposés. 00:00:48.019 --> 00:00:54.579 Ici, les limites de la séquence cible sont indiqués par la coloration violette et verte. 00:00:54.579 --> 00:01:00.009 Si on parcourt ces séquences dans le sens de cinq prime vers trois prime, qui est dans le même sens 00:01:00.009 --> 00:01:06.064 de la synthèse de l'ADN naturel, l'élongation marquée par la violette s'allonge le long d'un brin et l'élongation marquée par le vert 00:01:06.064 --> 00:01:09.039 s'allonge le long du brin complémentaire. 00:01:09.039 --> 00:01:15.729 Puisqu'il est difficile de montrer comment fonctionne la PCR en utilisant cette représentation double hélice de l'ADN, 00:01:15.729 --> 00:01:22.009 on vous montre un diagramme de l'ADN en approximation d'une échelle, qui est plus facile à comprendre. 00:01:22.009 --> 00:01:27.549 En plus de l'échantillon clinique, la réaction de PCR nécessite trois autres ingrédients. 00:01:27.549 --> 00:01:33.889 Tout d'abord, il faut y avoir un apport massif de chacun des quatre nucléotides. 00:01:33.889 --> 00:01:40.889 Deuxièmement, l'utilisateur doit ajouter une grande quantité de petites amorces synthétiques choisies 00:01:40.889 --> 00:01:47.006 pour s'hybrider à la séquence située à chaque extrémité de l'ADN cible. 00:01:47.006 --> 00:01:53.439 Les amorces sont les ingrédients qui rendent la réaction spécifique car seulement l'ADN qui 00:01:53.439 --> 00:01:58.929 se situe entre ces deux amorces seront synthétisées dans la réaction PCR. 00:01:58.929 --> 00:02:04.069 Troisièmement, la réaction nécessite l'enzyme ADN polymérase. 00:02:04.069 --> 00:02:10.539 Pour la PCR, la polymérase est en fait d'origine d'une bactérie qui se développe normalement dans la mer à proximité 00:02:10.539 --> 00:02:14.349 des chaudes cheminées hydrothermales sur le plancher océanique. 00:02:14.349 --> 00:02:20.054 La bactérie s'appelle 'Thermus aquaticus' et donc la polymérase s'appelle 'Taq polymérase' 00:02:20.054 --> 00:02:21.079 tout simplement. 00:02:21.079 --> 00:02:29.018 Cette enzyme exotique est utilisée car il n'est pas inactivée par les hautes températures générées 00:02:29.018 --> 00:02:31.047 pendant la réaction PCR. 00:02:31.047 --> 00:02:38.093 Tous ces acteurs sont introduits dans des proportions correctes dans le même tube et sont mélangés. Puis, on place le tube dans un appareil que l'on appelle 00:02:38.093 --> 00:02:40.059 un thermocycleur. 00:02:40.059 --> 00:02:47.379 Cet instrument peut être programmé pour modifier la température du mélange à travers une série 00:02:47.379 --> 00:02:49.939 des cycles répétitifs. 00:02:49.939 --> 00:02:57.051 On peut voir, dans la partie inférieure droite de l'écran, la température de la réaction durant cette démonstration. 00:02:57.051 --> 00:03:04.109 Dans le premier cycle de PCR, la température est élevée jusqu'au point où l'ADN se dénature 00:03:04.109 --> 00:03:08.089 et les brins complémentaires se séparent. 00:03:08.089 --> 00:03:14.709 La température est ensuite abaissée à un niveau suffisant pour que les brins complémentaires puissent se réassocier. 00:03:14.709 --> 00:03:24.189 Cependant, étant donné que les amorces sont présents en très grand excès dans le mélange, ils 00:03:24.189 --> 00:03:28.037 s'hybrideront probablement aux sites complémentaires lorsque les brins se réassocier. 00:03:28.037 --> 00:03:37.249 Pendant que la température est davantage abaissée, la polymérase retrouve les extrémités libres des 00:03:37.249 --> 00:03:44.012 amorces et l'enzyme commence à ajouter des nucléotides à l'extrémité de l'amorce en utilisant le 00:03:44.012 --> 00:03:45.359 brin complémentaire comme matrice. 00:03:45.359 --> 00:03:52.043 On voit le même processus dans la réplication de l'ADN pendant la division cellulaire normale. 00:03:52.043 --> 00:04:00.034 À la fin de la première cycle de PCR, on aura deux copies de la séquence cible pour 00:04:00.034 --> 00:04:04.499 chacune qui était présente dans l'échantillon clinique original. 00:04:04.499 --> 00:04:12.015 Vous pouvez suivre les produits de l'amplification dans le panneau qui s'affiche en bas et à gauche de l'écran. 00:04:12.015 --> 00:04:17.069 Le même processus se déroule pendant le second cycle de PCR. 00:04:17.069 --> 00:04:25.011 Le theromcycleur réchauffe considérablement l'échantillon pour que les brins d'ADN complémentaires puissent se séparer, 00:04:25.011 --> 00:04:28.091 y compris ceux qui viennent d'être synthétisés. 00:04:28.091 --> 00:04:35.022 Ensuite, la température est abaissée afin de permettre les amorces à se lier à leur sites spécifiques et promouvoir 00:04:35.022 --> 00:04:41.003 la synthèse de brins complémentaires par la Taq polymérase, lorsque la température est davantage et 00:04:41.003 --> 00:04:47.071 de nouveau abaissée 00:04:47.071 --> 00:04:54.037 Au troisième tour, la même cyclisation de la température de réaction se produit avec la dénaturation des 00:04:54.037 --> 00:05:00.097 brins, l'hybridisation des amorces lorsque la température est abaissée, et la synthèse du brin nouveau lorsque 00:05:00.097 --> 00:05:06.087 les brins sont prêts pour que l'ADN polymérase puisse commencer à ajouter des nucléotides. 00:05:06.087 --> 00:05:14.094 A la fin du troisième tour il y a maintenant huit copies doubles brins de la séquence cible 00:05:14.094 --> 00:05:18.079 où il en était à l'origine une seule. 00:05:18.079 --> 00:05:25.098 En regardant le diagramme aggrandissant du coin inférieur gauche de l'écran, on peut voir ce qui se passera avec des cycles successifs 00:05:25.098 --> 00:05:28.001 de PCR. 00:05:28.001 --> 00:05:34.025 Après chaque cycle, on double le nombre de copies de la séquence cible; donc il y aura seize 00:05:34.025 --> 00:05:42.012 copies après quatre cycles, 32 copies après cinq cycles, et 64 copies d'après 00:05:42.012 --> 00:05:44.003 six cycles. 00:05:44.003 --> 00:05:50.065 Au moment où le thermocycleur a fini 40 cycles, les amorces et les nucléotides seront 00:05:50.065 --> 00:05:57.061 probablement épuisés, mais il en théorie, on aura théoriquement dix à la douzième (10 ^ 12) copies. 00:05:57.061 --> 00:06:03.059 La séquence cible aura été amplifié un trillion de fois. 00:06:03.059 --> 00:06:11.059 Ce niveau d'amplification suffit à produire une quantité de l'ADN spécifique que l'on peut en visualiser 00:06:11.059 --> 00:06:14.081 par l'électrophorèse sur gel. 00:06:14.081 --> 00:06:22.088 La tache de l'ADN en haut du gel représente tout l'ADN qui était présent 00:06:22.088 --> 00:06:24.073 dans l'échantillon clinique. 00:06:24.073 --> 00:06:34.037 Notons cependant qu'il y des nouvelle taches plus petite dans les échantillons prélevés pendant les derniers cycles de PCR. 00:06:34.037 --> 00:06:43.058 À des fins de diagnostic en laboratoire, l'ADN amplifié peut être détecté et quantifié en utilisant des 00:06:43.058 --> 00:06:49.008 méthodes plus efficaces et plus simples que l'électrophorèse sur gel. 00:06:49.008 --> 00:06:52.840 On discute une de ces méthodes dans un programme d'accompagnement.