0:00:02.095,0:00:10.058 (Spanish/Español translation by Juliana Salomón, BA, Argentina. Reviewed by Dr. Gabriela Gorelik, University of Michigan.)[br]La reacción en cadena de la polimerasa (o PCR) puede apuntar y amplificar cualquier ácido nucleico específico de... 0:00:10.058,0:00:13.004 muestras biológicas complejas. 0:00:13.004,0:00:18.051 El procedimiento se puede utilizar en diagnósticos para determinar si una muestra clínica contiene... 0:00:18.051,0:00:23.047 una secuencia nuclear de un patógeno especíco. 0:00:23.047,0:00:31.005 O también pueden usar PCR para amplificar y marcar grandes cantidades de un determinado... 0:00:31.005,0:00:34.046 gen para investigación. 0:00:34.046,0:00:39.091 Para realizar la PCR se debe conocer la secuencia del ácido nucleico que desea amplificar. 0:00:39.091,0:00:45.072 Luego se definen los límites de la secuencia en estudio mediante la identificación de secuencias cortas en... 0:00:45.072,0:00:48.019 cada extremo de las cadenas opuestas. 0:00:48.019,0:00:54.579 Aquí, los límites de la secuencia diana se indican mediante el resaltado de violeta y verde. 0:00:54.579,0:01:00.009 Si se mueve desde estas secuencias en el cinco prima hacia el tres prima, la dirección... 0:01:00.009,0:01:06.064 de la síntesis de ADN normal, el resaltado violeta se extiende a lo largo de una cadena y el resaltado verde... 0:01:06.064,0:01:09.039 se extiende a lo largo de la cadena complementaria. 0:01:09.039,0:01:15.729 Es difícil mostrar cómo funciona la PCR utilizando esta representación de doble hélice del ADN, 0:01:15.729,0:01:22.009 así que se convertirá al diagrama en una imagen del ADN más fácil de entender. 0:01:22.009,0:01:27.549 Además de la muestra clínica, la PCR requiere tres ingredientes. 0:01:27.549,0:01:33.889 En primer lugar, debe haber un suministro masivo de cada uno de los cuatro nucleótidos. 0:01:33.889,0:01:40.889 En segundo lugar, el usuario debe añadir una gran cantidad de pequeños iniciadores sintéticos diseñados... 0:01:40.889,0:01:47.006 para hibridizar la secuencia de unión de cualquiera de los extremos del ADN diana. 0:01:47.006,0:01:53.439 Los iniciadores son los ingredientes que conforman la reacción específica dado que sólo el ADN... 0:01:53.439,0:01:58.929 que se encuentra entre estos dos cebadores será sintetizado en la reacción de PCR. 0:01:58.929,0:02:04.069 En tercer lugar, la reacción requiere de la enzima ADN polimerasa 0:02:04.069,0:02:10.539 Esta polimerasa para la PCR es en realidad de una bacteria que normalmente crece en el mar alrededor de... 0:02:10.539,0:02:14.349 respiraderos geotérmicos calientes en el fondo del océano. 0:02:14.349,0:02:20.054 La bacteria se llama Thermus aquaticus y la polimerasa se llama Taq polimerasa, 0:02:20.054,0:02:21.079 para abreviar. 0:02:21.079,0:02:29.018 Esta enzima exótica se utiliza porque no es inactivada por las altas temperaturas generadas... 0:02:29.018,0:02:31.047 en la reacción. 0:02:31.047,0:02:38.093 Todos estos elementos se mezclan en proporciones adecuadas y se colocan en un instrumento llamado... 0:02:38.093,0:02:40.059 termociclador. 0:02:40.059,0:02:47.379 Este instrumento puede ser programado para determinar la temperatura de la mezcla a través de una serie... 0:02:47.379,0:02:49.939 de ciclos repetitivos. 0:02:49.939,0:02:57.051 La temperatura de la reacción en esta demostración se presenta en el panel inferior derecho. 0:02:57.051,0:03:04.109 En la primer ronda de PCR la temperatura se eleva hasta un punto en que el ADN se funde... 0:03:04.109,0:03:08.089 y las cadenas complementarias se separan una de la otra. 0:03:08.089,0:03:14.709 Luego, la temperatura se baja a un nivel en el que las cadenas complementarias pueden volver a asociarse. 0:03:14.709,0:03:24.189 Sin embargo, dado que los cebadores están presentes en la mezcla en grandes cantidades, es más probable que... 0:03:24.189,0:03:28.037 se unan a los sitios complementarios cuando las cadenas se re-asocian. 0:03:28.037,0:03:37.249 A medida que la temperatura se reduce aún más, la polimerasa encuentra los extremos libres de los... 0:03:37.249,0:03:44.012 iniciadores y la enzima comienza a añadir nucleótidos al extremo del cebador utilizando la cadena... 0:03:44.012,0:03:45.359 complementaria como patrón. 0:03:45.359,0:03:52.043 El mismo proceso se produce cuando el ADN se replica en la división celular normal. 0:03:52.043,0:04:00.034 Al final de la primera ronda de la PCR habrá dos copias de la secuencia diana para cada... 0:04:00.034,0:04:04.499 uno de los que estaba presente en la muestra clínica. 0:04:04.499,0:04:12.015 Se puede hacer un seguimiento de la amplificación en el panel que aparecerá en la parte inferior izquierda. 0:04:12.015,0:04:17.069 El mismo proceso se repite en la segunda ronda de la PCR. 0:04:17.069,0:04:25.011 El termociclador calienta la muestra para separar las cadenas complementarias de ADN, 0:04:25.011,0:04:28.091 incluyendo aquellas que acaban de ser sintetizadas. 0:04:28.091,0:04:35.022 La temperatura se baja para permitir que los iniciadores se unan a sus sitios específicos y para que la... 0:04:35.022,0:04:41.003 Taq polimerasa sintetice las cadenas complementarias cuando la temperatura se baje... 0:04:41.003,0:04:47.071 de nuevo. 0:04:47.071,0:04:54.037 En la tercera ronda se produce el mismo ciclo con la temperatura de la reacción, se sube para la fusión de... 0:04:54.037,0:05:00.097 las cadenas, y luego se baja para la unión de los iniciadores y una nueva síntesis de la cadena ocurre cuando... 0:05:00.097,0:05:06.087 las cadenas están preparadas para que la ADN polimerasa inicie la adición de nucleótidos. 0:05:06.087,0:05:14.094 Al final de la tercera ronda habrá ocho copias de doble cadena de la secuencia diana, 0:05:14.094,0:05:18.079 donde originalmente había solo una. 0:05:18.079,0:05:25.098 El marco de la ampliación de la parte inferior izquierda mostrará ahora lo que ocurre con los ciclos sucesivos 0:05:25.098,0:05:28.001 de la PCR. 0:05:28.001,0:05:34.025 Con cada ciclo, el número de copias de la secuencia diana se duplica, por lo que habrá dieciséis... 0:05:34.025,0:05:42.012 copias después de cuatro ciclos, treinta y dos copias después de cinco ciclos, y sesenta y cuatro copias después... 0:05:42.012,0:05:44.003 de seis ciclos. 0:05:44.003,0:05:50.065 En el momento que el termociclador ha completado cuarenta ciclos los iniciadores y los nucleótidos... 0:05:50.065,0:05:57.061 probablemente se agotarán, pero en teoría quedarán diez a la doce (10e12) copias 0:05:57.061,0:06:03.059 La secuencia diana se habrá amplificado un billón de veces. 0:06:03.059,0:06:11.059 Este nivel de amplificación produce suficiente cantidad de ADN específico como para poder visualizarlo... 0:06:11.059,0:06:14.081 en un gel por electroforesis. 0:06:14.081,0:06:22.088 La banda grande de ADN en la parte superior del gel representa el complejo de ADN que estaba presente... 0:06:22.088,0:06:24.073 en la muestra clínica. 0:06:24.073,0:06:34.037 Sin embargo, una nueva banda más pequeña aparece en las muestras tomadas de los últimos ciclos de la PCR. 0:06:34.037,0:06:43.058 Para los propósitos de diagnóstico de laboratorio el ADN amplificado puede ser detectado y cuantificado por métodos... 0:06:43.058,0:06:49.008 más eficientes y más simples que el gel por electrophoresis. 0:06:49.008,0:06:52.840 Uno de estos métodos se describe en un programa adjunto.