WEBVTT 00:00:02.031 --> 00:00:09.061 (Portuguese/Português translation by Ana Julia Perrotti-Garcia, FFLCH USP SP, Freelance Translator & Interpreter) Este programa mostra como um ácido nucleico específico pode ser detectado e quantificado 00:00:09.061 --> 00:00:12.539 numa amostra clínical, utilizando PCR. 00:00:12.539 --> 00:00:19.949 Isto é feito pela detecção do acúmulo de produtos amplificados por PCR 00:00:19.949 --> 00:00:23.369 conforme são gerados na reação. 00:00:23.369 --> 00:00:29.098 E, assim, o processo é chamado "PCR em tempo-real" (RT-PCR). 00:00:29.098 --> 00:00:38.059 Para entender como os produtos amplificados por PCR, também chamados amplicons, são detectados em tempo real, 00:00:38.059 --> 00:00:46.047 primeiro, vamos analisar os eventos que ocorrem durante o ciclo normal da PCR. 00:00:46.047 --> 00:00:53.036 Lembre-se que o primeiro passo de cada ciclo de PCR consiste em elevar a temperatura da reação e 00:00:53.036 --> 00:00:55.094 derreter o DNA de dupla-fita. 00:00:55.094 --> 00:01:03.007 Em seguida, quando a temperatura é reduzida, os primers específicos se ligam 00:01:03.007 --> 00:01:06.084 às sequências de cada extremidade do DNA alvo. 00:01:06.084 --> 00:01:15.007 O DNA intermediário pode então ser sintetizado por reação da polimerase em sentidos opostos. 00:01:15.007 --> 00:01:21.729 Como resultado, são produzidas duas cópias com dupla-fita do DNA alvo, 00:01:21.729 --> 00:01:23.028 onde inicialmente havia apenas uma. 00:01:23.028 --> 00:01:30.229 Se tiver dúvidas sobre este processo básico, pode ser uma boa ideia 00:01:30.229 --> 00:01:35.499 rever o programa básico sobre PCR. 00:01:35.499 --> 00:01:41.067 Para detectar a geração de novos amplicons em tempo real, a reação de PCR requer 00:01:41.067 --> 00:01:50.017 algo mais: uma sonda de DNA de cadeia simples, desenvolvida para hibridizar-se 00:01:50.017 --> 00:01:54.329 com a parte da sequência de DNA sintetizada entre os dois primers. 00:01:54.329 --> 00:02:02.529 No entanto, ao contrário dos primers, esta sonda é especialmente mais definida. 00:02:02.529 --> 00:02:11.005 Um dos seus nucleotídeos é marcado com uma molécula fluorescente e um outro nucleótido é marcado 00:02:11.005 --> 00:02:16.004 com uma molécula quencher fluorescente. 00:02:16.004 --> 00:02:23.059 O quencher absorve rapidamente qualquer energia luminosa emitida pela molécula fluorescente, 00:02:23.059 --> 00:02:27.459 desde que esteja bem próxima. 00:02:27.459 --> 00:02:36.159 Agora, vamos ver o que acontece quando este ingrediente adicional está presente 00:02:36.159 --> 00:02:39.769 durante um ciclo de PCR. 00:02:39.769 --> 00:02:44.099 Outros primers ligam-se às cadeias separadas de DNA. 00:02:44.099 --> 00:02:49.029 A sonda também encontra seus locais complementares entre elas. 00:02:49.029 --> 00:02:56.629 A enzima que sintetiza DNA novo nas extremidades dos primers também têm uma segunda atividade: 00:02:56.629 --> 00:03:00.719 uma atividade exonuclear. 00:03:00.719 --> 00:03:07.409 Assim, quando encontra uma dupla fita de DNA, ela desmonta a fita 00:03:07.409 --> 00:03:12.098 que está em seu caminho, e substitui todos os nucleotídeos. 00:03:12.098 --> 00:03:18.379 Quando a polimerase passa pela sonda, percebe que o nucleotídeo contendo 00:03:18.379 --> 00:03:24.078 o marcador fluorescente e com quencher estão separados um do outro. 00:03:24.078 --> 00:03:32.299 Na ausência de um quencher próximo, a molécula fluorescente pode emitir luz detectável 00:03:32.299 --> 00:03:34.098 quando estimulada. 00:03:34.098 --> 00:03:41.098 Cada vez que um amplicon é produzido, um marcador fluorescente é libertado de um quencher próximo 00:03:41.098 --> 00:03:43.017 . 00:03:43.017 --> 00:03:50.299 Portanto, assim como o número de amplicons duplica em cada ciclo de PCR, 00:03:50.299 --> 00:03:52.959 a quantidade de energia fluorescente emitida também duplica. 00:03:52.959 --> 00:04:00.059 Esta geração de luz pode ser monitorada durante a reação de PCR 00:04:00.059 --> 00:04:02.012 por um termociclador equipado com fluorímetro. 00:04:02.012 --> 00:04:08.689 Então, se iniciamos com uma amostra clínica que tenha apenas uma cópia do DNA alvo, 00:04:08.689 --> 00:04:15.048 podem ser necessários mais de 40 ciclos antes dos amplicons serem detectados por um fluorímetro 00:04:15.048 --> 00:04:16.048 em um termociclador especializado. 00:04:16.048 --> 00:04:24.006 Mas, se a amostra original continha 32 vezes mais cópias do DNA alvo, 00:04:24.006 --> 00:04:30.069 Seriam necessários 5 ciclos de PCR a menos para ocorrer a detecção fluorimétrica. 00:04:30.069 --> 00:04:38.003 E se houver mais 1.024 sequências de DNA alvo na amostra original, 00:04:38.003 --> 00:04:42.139 então a fluorescência seria detectada 10 ciclos antes. 00:04:42.139 --> 00:04:48.025 Assim, a quantidade de DNA específico na amostra clínica é determinada referindo-se 00:04:48.025 --> 00:04:56.819 ao ciclo de PCR em que a quantidade de fluorescência ultrapassa o limite de detecção. 00:04:56.819 --> 00:05:04.043 RT-PCR é mais frequentemente usada para quantificar a carga viral no sangue de pacientes 00:05:04.043 --> 00:05:08.449 com HIV, hepatite B e outros vírus. 00:05:08.449 --> 00:05:19.289 Mas o HIV é um RNA vírus, que não tem DNA, e seu RNA é de cadeia simples. 00:05:19.289 --> 00:05:23.059 Então, como este método funciona? 00:05:23.059 --> 00:05:30.058 A resposta é que o RNA de um RNA vírus pode ser quantificado depois de ter sido copiado 00:05:30.058 --> 00:05:34.005 e convertido em DNA de dupla fita. 00:05:34.005 --> 00:05:42.389 Esta animação mostra como isso é feito. Em primeiro lugar, o RNA viral é liberado 00:05:42.389 --> 00:05:43.509 do vírion. 00:05:43.509 --> 00:05:51.096 Então, uma cadeia de DNA complementar é sintetizada a partir do RNA viral purificado 00:05:51.096 --> 00:05:56.021 utilizando transcriptase reversa, assim como faz na replicação natural. 00:05:56.021 --> 00:06:06.016 Em alguns protocolos, uma enzima RNAse especializada é adicionada para clivar o RNA 00:06:06.016 --> 00:06:08.005 permitir que seja degradado. 00:06:08.005 --> 00:06:15.539 Com ou sem essa parte do processo, o passo seguinte ocorre quando uma DNA polimerase 00:06:15.539 --> 00:06:22.066 e um primer geram uma fita de DNA complementar, como na PCR. 00:06:22.066 --> 00:06:31.669 No final desta reação, uma fita simples de RNA viral foi convertida em um DNA de dupla fita 00:06:31.669 --> 00:06:37.024 que possui a mesma sequência de bases nucleotídicas. 00:06:37.024 --> 00:06:42.610 A PCR qualitativa pode prosseguir tal como descrito anteriormente.