(Portuguese/Português translation by Ana Julia Perrotti-Garcia, FFLCH USP SP, Freelance Translator & Interpreter) Este programa mostra como um ácido nucleico específico pode ser detectado e quantificado
numa amostra clínical, utilizando PCR.
Isto é feito pela detecção do acúmulo de produtos amplificados por PCR
conforme são gerados na reação.
E, assim, o processo é chamado "PCR em tempo-real" (RT-PCR).
Para entender como os produtos amplificados por PCR, também chamados amplicons, são detectados em tempo real,
primeiro, vamos analisar os eventos que ocorrem durante o ciclo normal da PCR.
Lembre-se que o primeiro passo de cada ciclo de PCR consiste em elevar a temperatura da reação e
derreter o DNA de dupla-fita.
Em seguida, quando a temperatura é reduzida, os primers específicos se ligam
às sequências de cada extremidade do DNA alvo.
O DNA intermediário pode então ser sintetizado por reação da polimerase em sentidos opostos.
Como resultado, são produzidas duas cópias com dupla-fita do DNA alvo,
onde inicialmente havia apenas uma.
Se tiver dúvidas sobre este processo básico, pode ser uma boa ideia
rever o programa básico sobre PCR.
Para detectar a geração de novos amplicons em tempo real, a reação de PCR requer
algo mais: uma sonda de DNA de cadeia simples, desenvolvida para hibridizar-se
com a parte da sequência de DNA sintetizada entre os dois primers.
No entanto, ao contrário dos primers, esta sonda é especialmente mais definida.
Um dos seus nucleotídeos é marcado com uma molécula fluorescente e um outro nucleótido é marcado
com uma molécula quencher fluorescente.
O quencher absorve rapidamente qualquer energia luminosa emitida pela molécula fluorescente,
desde que esteja bem próxima.
Agora, vamos ver o que acontece quando este ingrediente adicional está presente
durante um ciclo de PCR.
Outros primers ligam-se às cadeias separadas de DNA.
A sonda também encontra seus locais complementares entre elas.
A enzima que sintetiza DNA novo nas extremidades dos primers também têm uma segunda atividade:
uma atividade exonuclear.
Assim, quando encontra uma dupla fita de DNA, ela desmonta a fita
que está em seu caminho, e substitui todos os nucleotídeos.
Quando a polimerase passa pela sonda, percebe que o nucleotídeo contendo
o marcador fluorescente e com quencher estão separados um do outro.
Na ausência de um quencher próximo, a molécula fluorescente pode emitir luz detectável
quando estimulada.
Cada vez que um amplicon é produzido, um marcador fluorescente é libertado de um quencher próximo
.
Portanto, assim como o número de amplicons duplica em cada ciclo de PCR,
a quantidade de energia fluorescente emitida também duplica.
Esta geração de luz pode ser monitorada durante a reação de PCR
por um termociclador equipado com fluorímetro.
Então, se iniciamos com uma amostra clínica que tenha apenas uma cópia do DNA alvo,
podem ser necessários mais de 40 ciclos antes dos amplicons serem detectados por um fluorímetro
em um termociclador especializado.
Mas, se a amostra original continha 32 vezes mais cópias do DNA alvo,
Seriam necessários 5 ciclos de PCR a menos para ocorrer a detecção fluorimétrica.
E se houver mais 1.024 sequências de DNA alvo na amostra original,
então a fluorescência seria detectada 10 ciclos antes.
Assim, a quantidade de DNA específico na amostra clínica é determinada referindo-se
ao ciclo de PCR em que a quantidade de fluorescência ultrapassa o limite de detecção.
RT-PCR é mais frequentemente usada para quantificar a carga viral no sangue de pacientes
com HIV, hepatite B e outros vírus.
Mas o HIV é um RNA vírus, que não tem DNA, e seu RNA é de cadeia simples.
Então, como este método funciona?
A resposta é que o RNA de um RNA vírus pode ser quantificado depois de ter sido copiado
e convertido em DNA de dupla fita.
Esta animação mostra como isso é feito. Em primeiro lugar, o RNA viral é liberado
do vírion.
Então, uma cadeia de DNA complementar é sintetizada a partir do RNA viral purificado
utilizando transcriptase reversa, assim como faz na replicação natural.
Em alguns protocolos, uma enzima RNAse especializada é adicionada para clivar o RNA
permitir que seja degradado.
Com ou sem essa parte do processo, o passo seguinte ocorre quando uma DNA polimerase
e um primer geram uma fita de DNA complementar, como na PCR.
No final desta reação, uma fita simples de RNA viral foi convertida em um DNA de dupla fita
que possui a mesma sequência de bases nucleotídicas.
A PCR qualitativa pode prosseguir tal como descrito anteriormente.