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00:00:02,031 --> 00:00:09,061
(Portuguese/Português translation by Ana Julia Perrotti-Garcia, FFLCH USP SP, Freelance Translator & Interpreter)
Este programa mostra como um ácido nucleico específico pode ser detectado e quantificado

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00:00:09,061 --> 00:00:12,539
numa amostra clínical, utilizando PCR.

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00:00:12,539 --> 00:00:19,949
Isto é feito pela detecção do acúmulo de produtos amplificados por PCR

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00:00:19,949 --> 00:00:23,369
conforme são gerados na reação.

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00:00:23,369 --> 00:00:29,098
E, assim, o processo é chamado "PCR em tempo-real" (RT-PCR).

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00:00:29,098 --> 00:00:38,059
Para entender como os produtos amplificados por PCR, também chamados amplicons, são detectados em tempo real,

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00:00:38,059 --> 00:00:46,047
primeiro, vamos analisar os eventos que ocorrem durante o ciclo normal da PCR.

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00:00:46,047 --> 00:00:53,036
Lembre-se que o primeiro passo de cada ciclo de PCR consiste em elevar a temperatura da reação e

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00:00:53,036 --> 00:00:55,094
derreter o DNA de dupla-fita.

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00:00:55,094 --> 00:01:03,007
Em seguida, quando a temperatura é reduzida, os primers específicos se ligam

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00:01:03,007 --> 00:01:06,084
às sequências de cada extremidade do DNA alvo.

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00:01:06,084 --> 00:01:15,007
O DNA intermediário pode então ser sintetizado por reação da polimerase em sentidos opostos.

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00:01:15,007 --> 00:01:21,729
Como resultado, são produzidas duas cópias com dupla-fita do DNA alvo,

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00:01:21,729 --> 00:01:23,028
onde inicialmente havia apenas uma.

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00:01:23,028 --> 00:01:30,229
Se tiver dúvidas sobre este processo básico, pode ser uma boa ideia

16
00:01:30,229 --> 00:01:35,499
rever o programa básico sobre PCR.

17
00:01:35,499 --> 00:01:41,067
Para detectar a geração de novos amplicons em tempo real, a reação de PCR requer

18
00:01:41,067 --> 00:01:50,017
algo mais: uma sonda de DNA de cadeia simples, desenvolvida para hibridizar-se

19
00:01:50,017 --> 00:01:54,329
com a parte da sequência de DNA sintetizada entre os dois primers.

20
00:01:54,329 --> 00:02:02,529
No entanto, ao contrário dos primers, esta sonda é especialmente mais definida.

21
00:02:02,529 --> 00:02:11,005
Um dos seus nucleotídeos é marcado com uma molécula fluorescente e um outro nucleótido é marcado

22
00:02:11,005 --> 00:02:16,004
com uma molécula quencher fluorescente.

23
00:02:16,004 --> 00:02:23,059
O quencher absorve rapidamente qualquer energia luminosa emitida pela molécula fluorescente,

24
00:02:23,059 --> 00:02:27,459
desde que esteja bem próxima.

25
00:02:27,459 --> 00:02:36,159
Agora, vamos ver o que acontece quando este ingrediente adicional está presente

26
00:02:36,159 --> 00:02:39,769
durante um ciclo de PCR.

27
00:02:39,769 --> 00:02:44,099
Outros primers ligam-se às cadeias separadas de DNA.

28
00:02:44,099 --> 00:02:49,029
A sonda também encontra seus locais complementares entre elas.

29
00:02:49,029 --> 00:02:56,629
A enzima que sintetiza DNA novo nas extremidades dos primers também têm uma segunda atividade:

30
00:02:56,629 --> 00:03:00,719
uma atividade exonuclear.

31
00:03:00,719 --> 00:03:07,409
Assim, quando encontra uma dupla fita de DNA, ela desmonta a fita

32
00:03:07,409 --> 00:03:12,098
que está em seu caminho, e substitui todos os nucleotídeos.

33
00:03:12,098 --> 00:03:18,379
Quando a polimerase passa pela sonda, percebe que o nucleotídeo contendo

34
00:03:18,379 --> 00:03:24,078
o marcador fluorescente e com quencher estão separados um do outro.

35
00:03:24,078 --> 00:03:32,299
Na ausência de um quencher próximo, a molécula fluorescente pode emitir luz detectável

36
00:03:32,299 --> 00:03:34,098
quando estimulada.

37
00:03:34,098 --> 00:03:41,098
Cada vez que um amplicon é produzido, um marcador fluorescente é libertado de um quencher próximo

38
00:03:41,098 --> 00:03:43,017
.

39
00:03:43,017 --> 00:03:50,299
Portanto, assim como o número de amplicons duplica em cada ciclo de PCR,

40
00:03:50,299 --> 00:03:52,959
a quantidade de energia fluorescente emitida também duplica.

41
00:03:52,959 --> 00:04:00,059
Esta geração de luz pode ser monitorada durante a reação de PCR

42
00:04:00,059 --> 00:04:02,012
por um termociclador equipado com fluorímetro.

43
00:04:02,012 --> 00:04:08,689
Então, se iniciamos com uma amostra clínica que tenha apenas uma cópia do DNA alvo,

44
00:04:08,689 --> 00:04:15,048
podem ser necessários mais de 40 ciclos antes dos amplicons serem detectados por um fluorímetro

45
00:04:15,048 --> 00:04:16,048
em um termociclador especializado.

46
00:04:16,048 --> 00:04:24,006
Mas, se a amostra original continha 32 vezes mais cópias do DNA alvo,

47
00:04:24,006 --> 00:04:30,069
Seriam necessários 5 ciclos de PCR a menos para ocorrer a detecção fluorimétrica.

48
00:04:30,069 --> 00:04:38,003
E se houver mais 1.024 sequências de DNA alvo na amostra original,

49
00:04:38,003 --> 00:04:42,139
então a fluorescência seria detectada 10 ciclos antes.

50
00:04:42,139 --> 00:04:48,025
Assim, a quantidade de DNA específico na amostra clínica é determinada referindo-se

51
00:04:48,025 --> 00:04:56,819
ao ciclo de PCR em que a quantidade de fluorescência ultrapassa o limite de detecção.

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00:04:56,819 --> 00:05:04,043
RT-PCR é mais frequentemente usada para quantificar a carga viral no sangue de pacientes

53
00:05:04,043 --> 00:05:08,449
com HIV, hepatite B e outros vírus.

54
00:05:08,449 --> 00:05:19,289
Mas o HIV é um RNA vírus, que não tem DNA, e seu RNA é de cadeia simples.

55
00:05:19,289 --> 00:05:23,059
Então, como este método funciona?

56
00:05:23,059 --> 00:05:30,058
A resposta é que o RNA de um RNA vírus pode ser quantificado depois de ter sido copiado

57
00:05:30,058 --> 00:05:34,005
e convertido em DNA de dupla fita.

58
00:05:34,005 --> 00:05:42,389
Esta animação mostra como isso é feito. Em primeiro lugar, o RNA viral é liberado

59
00:05:42,389 --> 00:05:43,509
do vírion.

60
00:05:43,509 --> 00:05:51,096
Então, uma cadeia de DNA complementar é sintetizada a partir do RNA viral purificado

61
00:05:51,096 --> 00:05:56,021
utilizando transcriptase reversa, assim como faz na replicação natural.

62
00:05:56,021 --> 00:06:06,016
Em alguns protocolos, uma enzima RNAse especializada é adicionada para clivar o RNA

63
00:06:06,016 --> 00:06:08,005
permitir que seja degradado.

64
00:06:08,005 --> 00:06:15,539
Com ou sem essa parte do processo, o passo seguinte ocorre quando uma DNA polimerase

65
00:06:15,539 --> 00:06:22,066
e um primer geram uma fita de DNA complementar, como na PCR.

66
00:06:22,066 --> 00:06:31,669
No final desta reação, uma fita simples de RNA viral foi convertida em um DNA de dupla fita

67
00:06:31,669 --> 00:06:37,024
que possui a mesma sequência de bases nucleotídicas.

68
00:06:37,024 --> 00:06:42,610
A PCR qualitativa pode prosseguir tal como descrito anteriormente.