0:00:02.031,0:00:09.061
(Portuguese/Português translation by Ana Julia Perrotti-Garcia, FFLCH USP SP, Freelance Translator & Interpreter)[br]Este programa mostra como um ácido nucleico específico pode ser detectado e quantificado

0:00:09.061,0:00:12.539
numa amostra clínical, utilizando PCR.

0:00:12.539,0:00:19.949
Isto é feito pela detecção do acúmulo de produtos amplificados por PCR

0:00:19.949,0:00:23.369
conforme são gerados na reação.

0:00:23.369,0:00:29.098
E, assim, o processo é chamado "PCR em tempo-real" (RT-PCR).

0:00:29.098,0:00:38.059
Para entender como os produtos amplificados por PCR, também chamados amplicons, são detectados em tempo real,

0:00:38.059,0:00:46.047
primeiro, vamos analisar os eventos que ocorrem durante o ciclo normal da PCR.

0:00:46.047,0:00:53.036
Lembre-se que o primeiro passo de cada ciclo de PCR consiste em elevar a temperatura da reação e

0:00:53.036,0:00:55.094
derreter o DNA de dupla-fita.

0:00:55.094,0:01:03.007
Em seguida, quando a temperatura é reduzida, os primers específicos se ligam

0:01:03.007,0:01:06.084
às sequências de cada extremidade do DNA alvo.

0:01:06.084,0:01:15.007
O DNA intermediário pode então ser sintetizado por reação da polimerase em sentidos opostos.

0:01:15.007,0:01:21.729
Como resultado, são produzidas duas cópias com dupla-fita do DNA alvo,

0:01:21.729,0:01:23.028
onde inicialmente havia apenas uma.

0:01:23.028,0:01:30.229
Se tiver dúvidas sobre este processo básico, pode ser uma boa ideia

0:01:30.229,0:01:35.499
rever o programa básico sobre PCR.

0:01:35.499,0:01:41.067
Para detectar a geração de novos amplicons em tempo real, a reação de PCR requer

0:01:41.067,0:01:50.017
algo mais: uma sonda de DNA de cadeia simples, desenvolvida para hibridizar-se

0:01:50.017,0:01:54.329
com a parte da sequência de DNA sintetizada entre os dois primers.

0:01:54.329,0:02:02.529
No entanto, ao contrário dos primers, esta sonda é especialmente mais definida.

0:02:02.529,0:02:11.005
Um dos seus nucleotídeos é marcado com uma molécula fluorescente e um outro nucleótido é marcado

0:02:11.005,0:02:16.004
com uma molécula quencher fluorescente.

0:02:16.004,0:02:23.059
O quencher absorve rapidamente qualquer energia luminosa emitida pela molécula fluorescente,

0:02:23.059,0:02:27.459
desde que esteja bem próxima.

0:02:27.459,0:02:36.159
Agora, vamos ver o que acontece quando este ingrediente adicional está presente

0:02:36.159,0:02:39.769
durante um ciclo de PCR.

0:02:39.769,0:02:44.099
Outros primers ligam-se às cadeias separadas de DNA.

0:02:44.099,0:02:49.029
A sonda também encontra seus locais complementares entre elas.

0:02:49.029,0:02:56.629
A enzima que sintetiza DNA novo nas extremidades dos primers também têm uma segunda atividade:

0:02:56.629,0:03:00.719
uma atividade exonuclear.

0:03:00.719,0:03:07.409
Assim, quando encontra uma dupla fita de DNA, ela desmonta a fita

0:03:07.409,0:03:12.098
que está em seu caminho, e substitui todos os nucleotídeos.

0:03:12.098,0:03:18.379
Quando a polimerase passa pela sonda, percebe que o nucleotídeo contendo

0:03:18.379,0:03:24.078
o marcador fluorescente e com quencher estão separados um do outro.

0:03:24.078,0:03:32.299
Na ausência de um quencher próximo, a molécula fluorescente pode emitir luz detectável

0:03:32.299,0:03:34.098
quando estimulada.

0:03:34.098,0:03:41.098
Cada vez que um amplicon é produzido, um marcador fluorescente é libertado de um quencher próximo

0:03:41.098,0:03:43.017
.

0:03:43.017,0:03:50.299
Portanto, assim como o número de amplicons duplica em cada ciclo de PCR,

0:03:50.299,0:03:52.959
a quantidade de energia fluorescente emitida também duplica.

0:03:52.959,0:04:00.059
Esta geração de luz pode ser monitorada durante a reação de PCR

0:04:00.059,0:04:02.012
por um termociclador equipado com fluorímetro.

0:04:02.012,0:04:08.689
Então, se iniciamos com uma amostra clínica que tenha apenas uma cópia do DNA alvo,

0:04:08.689,0:04:15.048
podem ser necessários mais de 40 ciclos antes dos amplicons serem detectados por um fluorímetro

0:04:15.048,0:04:16.048
em um termociclador especializado.

0:04:16.048,0:04:24.006
Mas, se a amostra original continha 32 vezes mais cópias do DNA alvo,

0:04:24.006,0:04:30.069
Seriam necessários 5 ciclos de PCR a menos para ocorrer a detecção fluorimétrica.

0:04:30.069,0:04:38.003
E se houver mais 1.024 sequências de DNA alvo na amostra original,

0:04:38.003,0:04:42.139
então a fluorescência seria detectada 10 ciclos antes.

0:04:42.139,0:04:48.025
Assim, a quantidade de DNA específico na amostra clínica é determinada referindo-se

0:04:48.025,0:04:56.819
ao ciclo de PCR em que a quantidade de fluorescência ultrapassa o limite de detecção.

0:04:56.819,0:05:04.043
RT-PCR é mais frequentemente usada para quantificar a carga viral no sangue de pacientes

0:05:04.043,0:05:08.449
com HIV, hepatite B e outros vírus.

0:05:08.449,0:05:19.289
Mas o HIV é um RNA vírus, que não tem DNA, e seu RNA é de cadeia simples.

0:05:19.289,0:05:23.059
Então, como este método funciona?

0:05:23.059,0:05:30.058
A resposta é que o RNA de um RNA vírus pode ser quantificado depois de ter sido copiado

0:05:30.058,0:05:34.005
e convertido em DNA de dupla fita.

0:05:34.005,0:05:42.389
Esta animação mostra como isso é feito. Em primeiro lugar, o RNA viral é liberado

0:05:42.389,0:05:43.509
do vírion.

0:05:43.509,0:05:51.096
Então, uma cadeia de DNA complementar é sintetizada a partir do RNA viral purificado

0:05:51.096,0:05:56.021
utilizando transcriptase reversa, assim como faz na replicação natural.

0:05:56.021,0:06:06.016
Em alguns protocolos, uma enzima RNAse especializada é adicionada para clivar o RNA

0:06:06.016,0:06:08.005
permitir que seja degradado.

0:06:08.005,0:06:15.539
Com ou sem essa parte do processo, o passo seguinte ocorre quando uma DNA polimerase

0:06:15.539,0:06:22.066
e um primer geram uma fita de DNA complementar, como na PCR.

0:06:22.066,0:06:31.669
No final desta reação, uma fita simples de RNA viral foi convertida em um DNA de dupla fita

0:06:31.669,0:06:37.024
que possui a mesma sequência de bases nucleotídicas.

0:06:37.024,0:06:42.610
A PCR qualitativa pode prosseguir tal como descrito anteriormente.