1
00:00:00,000 --> 00:00:02,840
researchlabs@ واحد آموزشی شرکت طب یاران سیلک یاخته

2
00:00:02,840 --> 00:00:05,860
این ویدیو نشان می دهد که چگونه می توان با استفاده از

3
00:00:05,860 --> 00:00:09,330
PCR یک نوکلئیک اسید خاص را در نمونه های بالینی

4
00:00:09,330 --> 00:00:12,720
شناسایی کردو مفدار ان را سنجید

5
00:00:13,326 --> 00:00:23,236
این موضوع با شناسایی محصول PCR تکثیر شده انجام می شود

6
00:00:23,656 --> 00:00:31,186
این فرایند Real time PCRیا RT PCR نامیده می شود

7
00:00:31,249 --> 00:00:39,659
برای اینکه بفهمیم محصولات PCR چگونه شناسایی می شوند،

8
00:00:39,659 --> 00:00:45,779
در ابتدا باید اتفاقاتی که در یک سیکل PCR می افتد را بررسی کنیم.

9
00:00:46,492 --> 00:00:52,542
اولین مرحله در PCR، افزایش دمای واکنش

10
00:00:52,542 --> 00:00:56,182
و ذوب کردن dna دورشته ای می باشد.

11
00:00:56,182 --> 00:00:59,012
سپس وقتی که دما پایین امد،

12
00:00:59,012 --> 00:01:06,412
پرایمرهای اختصاصی به توالی های انتهایی dna می چسبند.

13
00:01:06,919 --> 00:01:12,739
حالا DNA جدید می تواند با فعالیت آنزیم پلیمراز

14
00:01:12,739 --> 00:01:16,079
در جهت های مخالف ساخته شود.

15
00:01:16,079 --> 00:01:20,999
در نتیجه دو کپی از DNA اولیه وجود خواهد داشت.

16
00:01:24,554 --> 00:01:28,034
اگر این فرایند را متوجه نشدید

17
00:01:28,034 --> 00:01:34,314
، ویدیوهای مربوط به PCRساده را یکبار دیگر مرور کنید.

18
00:01:35,788 --> 00:01:39,748
برای شناسایی تولید محصولات جدید در RT PCR،

19
00:01:39,748 --> 00:01:43,388
واکنش PCR نیاز به مواد دیگری نیز دارد:

20
00:01:44,244 --> 00:01:47,514
یک پروب DNAتک رشته ای.

21
00:01:47,514 --> 00:01:52,189
این پروب برای جفت شدن با بخشی از DNA طراحی شده است

22
00:01:52,189 --> 00:01:55,354
که در بین دو پرایمر سنتز می شود.

23
00:01:55,421 --> 00:01:59,176
به هرحال بر خلاف پرایمرها، این پروب با روش های اختصاصی

24
00:01:59,176 --> 00:02:02,081
شناسایی می شود.و حساسیت شناسایی را بالا می برد

25
00:02:02,081 --> 00:02:08,821
یکی از این نوکلئوتیدها با یک مولکول فلورسنت

26
00:02:08,821 --> 00:02:16,541
و دیگری با مولکول QUENCHER یا خاموش کننده لیبل می شود.

27
00:02:16,636 --> 00:02:20,786
مولکول خاموش کننده، به سرعت انرژی نورهای متساعدشده از

28
00:02:20,786 --> 00:02:23,136
فلورسنت را جذب می کند.

29
00:02:23,136 --> 00:02:26,706
البته تا زمانی که در فاصله نزدیکی از یکدیگر باقی بمانند.

30
00:02:30,385 --> 00:02:38,465
حالا بیایید ببینیم وقتی این مواد در واکنش حضور دارند، چه اتفاقی می افتد.

31
00:02:40,039 --> 00:02:44,039
پرایمرها به رشته های DNA جدا شده، می چسبد.

32
00:02:44,039 --> 00:02:48,039
پروب هم به جایگاه مکمل بین پرایمرها متصل می شود.

33
00:02:49,576 --> 00:02:54,966
انزیم، از دو انتهای پرایمرها، DNA جدید را می سازد.

34
00:02:54,966 --> 00:02:59,926
هم چنین این انزیم یک فعالیت خارج هسته ای دیگر هم دارد:

35
00:03:00,904 --> 00:03:04,904
این انزیم وقتی در مسیر خود به DNAدو رشته ای می رسد،

36
00:03:04,977 --> 00:03:08,217
تمامی نوکلئوتیدهای DNA را جدا کرده

37
00:03:08,217 --> 00:03:11,997
و ان ها دوباره جایگزین می کند.

38
00:03:12,930 --> 00:03:16,220
زمانی که پلیمراز، از پروب عبور می کند،

39
00:03:16,220 --> 00:03:24,690
نوکلئوتید دارای مارکر فلورسنت و خاموش کننده را از هم جدا می کند.

40
00:03:24,690 --> 00:03:31,390
وقتی این دو مارکر جدا شدند، مولکول فلورسنت در صورت تحریک

41
00:03:31,390 --> 00:03:34,738
میتواند نور قابل تشخیصی را تولید کند.

42
00:03:34,738 --> 00:03:38,363
هر بار که رشته جدید از DNA ساخته می شود،

43
00:03:38,363 --> 00:03:42,938
یک مولکول فلورسنت از خاموش کننده خود جدا می ماند.

44
00:03:43,060 --> 00:03:48,860
بنابراین با دوبرابر شدن مقدار DNA در هر سیکل PCR،

45
00:03:48,860 --> 00:03:53,760
مقدار انرژی تولیدی توسط فلورسنت نیز بالا می رود.

46
00:03:53,824 --> 00:04:02,154
این انرژی زیاد توسط یک فلورمتر در داخل 
دستگاه ترموسایکلر اندازه گیری می شود.

47
00:04:02,716 --> 00:04:09,286
بنابراین اگر شما فرایند را با نمونه بالینی دارای یک کپی از DNA اغاز کنید،

48
00:04:09,342 --> 00:04:12,782
به اندازه 40 سیکل PCR زمان می برد

49
00:04:12,782 --> 00:04:16,862
تا این انرژی از طریق فلورمتر دستگاه، شناسایی شود.

50
00:04:17,227 --> 00:04:24,372
اگر نمونه شما دارای بیش از 32 کپی از DNA باشد،

51
00:04:24,372 --> 00:04:30,617
فرایند شناسایی در طی 5 سیکل کمتر اتفاق می افتد.

52
00:04:31,621 --> 00:04:36,921
و اگر 1024 برابر بیشتر از نمونه خود را داشته باشید،

53
00:04:36,921 --> 00:04:42,461
فلورسنت در طی 10 سیکل کمتر شناسایی خواهد شد.

54
00:04:43,168 --> 00:04:50,493
بنابراین مقدار DNA موجود در نمونه،
با توجه به تعداد سیکل های PCR شناسایی خواهد شد.

55
00:04:50,493 --> 00:04:57,063
زیرا مقدار فلورسنت نمونه به پایین ترین حد استانه تشخیص رسبده است

56
00:04:57,063 --> 00:05:05,548
RT PCR معمولا برای شناسایی مقدار ویروس در خون بیماران HIV ،

57
00:05:05,548 --> 00:05:10,483
هپاتیت B و دیگر ویروس ها به کار می رود

58
00:05:10,483 --> 00:05:15,363
اما HIV یک ویروس دارای RNA است و DNA ندارد.

59
00:05:15,372 --> 00:05:18,932
RNAتک رشته ای است.

60
00:05:18,932 --> 00:05:24,072
بنابراین این فرایند چگونه انجام می شود؟

61
00:05:24,213 --> 00:05:28,293
پاسخ این است: RNA بعد از کپی شدن

62
00:05:28,293 --> 00:05:33,883
یا تبدیل شدن به DNA دو رشته ای اندازه گیری می شود.

63
00:05:33,901 --> 00:05:37,901
این انیمیشن چگونگی این موضوع را نشان می دهد.

64
00:05:39,173 --> 00:05:44,158
در ابتدا RNA ویروسی از ویروس ازاد میشود

65
00:05:44,158 --> 00:05:53,963
سپس با استفاده از انزیم ریورس ترنس کریپتاز، از RNA ویروسی یک DNA مکمل ساخته می شود.

66
00:05:55,343 --> 00:05:56,343
مشابه عمل ترجمه ی طبیعی که اتفاق می افتد

67
00:05:57,724 --> 00:06:02,839
در بعضی از پروتوکل ها یک انزیم RNase اختصاصی هم اضافه می شود

68
00:06:02,839 --> 00:06:07,034
تا RNA را بسازد و به ان اجازه می دهد تا تجزیه شود.

69
00:06:08,601 --> 00:06:14,056
جدا از اینکه این مرحله اتفاق بیوفتد یا نه، مرحله کلیدی بعدی این است

70
00:06:14,056 --> 00:06:23,531
که مشابه با واکنش PCR، DNAپلیمراز و پرایمر یک رشته DNA مکمل را می سازد.

71
00:06:23,541 --> 00:06:30,376
در انتهای واکنش، RNA تک رشته ای ویروسی

72
00:06:30,376 --> 00:06:37,212
به DNA دور شته ای تبدیل شده که همان نوکلئوتیدها را دارد.

73
00:06:37,318 --> 00:06:43,321
حالا فرایند PCR می تواند برای این ,DNA همانند قبل انجام شود.

74
00:06:43,321 --> 00:06:43,571
researchlabs@ مرجع دانلود ویدئو های آموزشی