researchlabs@ واحد آموزشی شرکت طب یاران سیلک یاخته
این ویدیو نشان می دهد که چگونه می توان با استفاده از
PCR یک نوکلئیک اسید خاص را در نمونه های بالینی
شناسایی کردو مفدار ان را سنجید
این موضوع با شناسایی محصول PCR تکثیر شده انجام می شود
این فرایند Real time PCRیا RT PCR نامیده می شود
برای اینکه بفهمیم محصولات PCR چگونه شناسایی می شوند،
در ابتدا باید اتفاقاتی که در یک سیکل PCR می افتد را بررسی کنیم.
اولین مرحله در PCR، افزایش دمای واکنش
و ذوب کردن dna دورشته ای می باشد.
سپس وقتی که دما پایین امد،
پرایمرهای اختصاصی به توالی های انتهایی dna می چسبند.
حالا DNA جدید می تواند با فعالیت آنزیم پلیمراز
در جهت های مخالف ساخته شود.
در نتیجه دو کپی از DNA اولیه وجود خواهد داشت.
اگر این فرایند را متوجه نشدید
، ویدیوهای مربوط به PCRساده را یکبار دیگر مرور کنید.
برای شناسایی تولید محصولات جدید در RT PCR،
واکنش PCR نیاز به مواد دیگری نیز دارد:
یک پروب DNAتک رشته ای.
این پروب برای جفت شدن با بخشی از DNA طراحی شده است
که در بین دو پرایمر سنتز می شود.
به هرحال بر خلاف پرایمرها، این پروب با روش های اختصاصی
شناسایی می شود.و حساسیت شناسایی را بالا می برد
یکی از این نوکلئوتیدها با یک مولکول فلورسنت
و دیگری با مولکول QUENCHER یا خاموش کننده لیبل می شود.
مولکول خاموش کننده، به سرعت انرژی نورهای متساعدشده از
فلورسنت را جذب می کند.
البته تا زمانی که در فاصله نزدیکی از یکدیگر باقی بمانند.
حالا بیایید ببینیم وقتی این مواد در واکنش حضور دارند، چه اتفاقی می افتد.
پرایمرها به رشته های DNA جدا شده، می چسبد.
پروب هم به جایگاه مکمل بین پرایمرها متصل می شود.
انزیم، از دو انتهای پرایمرها، DNA جدید را می سازد.
هم چنین این انزیم یک فعالیت خارج هسته ای دیگر هم دارد:
این انزیم وقتی در مسیر خود به DNAدو رشته ای می رسد،
تمامی نوکلئوتیدهای DNA را جدا کرده
و ان ها دوباره جایگزین می کند.
زمانی که پلیمراز، از پروب عبور می کند،
نوکلئوتید دارای مارکر فلورسنت و خاموش کننده را از هم جدا می کند.
وقتی این دو مارکر جدا شدند، مولکول فلورسنت در صورت تحریک
میتواند نور قابل تشخیصی را تولید کند.
هر بار که رشته جدید از DNA ساخته می شود،
یک مولکول فلورسنت از خاموش کننده خود جدا می ماند.
بنابراین با دوبرابر شدن مقدار DNA در هر سیکل PCR،
مقدار انرژی تولیدی توسط فلورسنت نیز بالا می رود.
این انرژی زیاد توسط یک فلورمتر در داخل دستگاه ترموسایکلر اندازه گیری می شود.
بنابراین اگر شما فرایند را با نمونه بالینی دارای یک کپی از DNA اغاز کنید،
به اندازه 40 سیکل PCR زمان می برد
تا این انرژی از طریق فلورمتر دستگاه، شناسایی شود.
اگر نمونه شما دارای بیش از 32 کپی از DNA باشد،
فرایند شناسایی در طی 5 سیکل کمتر اتفاق می افتد.
و اگر 1024 برابر بیشتر از نمونه خود را داشته باشید،
فلورسنت در طی 10 سیکل کمتر شناسایی خواهد شد.
بنابراین مقدار DNA موجود در نمونه، با توجه به تعداد سیکل های PCR شناسایی خواهد شد.
زیرا مقدار فلورسنت نمونه به پایین ترین حد استانه تشخیص رسبده است
RT PCR معمولا برای شناسایی مقدار ویروس در خون بیماران HIV ،
هپاتیت B و دیگر ویروس ها به کار می رود
اما HIV یک ویروس دارای RNA است و DNA ندارد.
RNAتک رشته ای است.
بنابراین این فرایند چگونه انجام می شود؟
پاسخ این است: RNA بعد از کپی شدن
یا تبدیل شدن به DNA دو رشته ای اندازه گیری می شود.
این انیمیشن چگونگی این موضوع را نشان می دهد.
در ابتدا RNA ویروسی از ویروس ازاد میشود
سپس با استفاده از انزیم ریورس ترنس کریپتاز، از RNA ویروسی یک DNA مکمل ساخته می شود.
مشابه عمل ترجمه ی طبیعی که اتفاق می افتد
در بعضی از پروتوکل ها یک انزیم RNase اختصاصی هم اضافه می شود
تا RNA را بسازد و به ان اجازه می دهد تا تجزیه شود.
جدا از اینکه این مرحله اتفاق بیوفتد یا نه، مرحله کلیدی بعدی این است
که مشابه با واکنش PCR، DNAپلیمراز و پرایمر یک رشته DNA مکمل را می سازد.
در انتهای واکنش، RNA تک رشته ای ویروسی
به DNA دور شته ای تبدیل شده که همان نوکلئوتیدها را دارد.
حالا فرایند PCR می تواند برای این ,DNA همانند قبل انجام شود.
researchlabs@ مرجع دانلود ویدئو های آموزشی