0:00:00.000,0:00:02.840
researchlabs@ واحد آموزشی شرکت طب یاران سیلک یاخته

0:00:02.840,0:00:05.860
این ویدیو نشان می دهد که چگونه می توان با استفاده از

0:00:05.860,0:00:09.330
PCR یک نوکلئیک اسید خاص را در نمونه های بالینی

0:00:09.330,0:00:12.720
شناسایی کردو مفدار ان را سنجید

0:00:13.326,0:00:23.236
این موضوع با شناسایی محصول PCR تکثیر شده انجام می شود

0:00:23.656,0:00:31.186
این فرایند Real time PCRیا RT PCR نامیده می شود

0:00:31.249,0:00:39.659
برای اینکه بفهمیم محصولات PCR چگونه شناسایی می شوند،

0:00:39.659,0:00:45.779
در ابتدا باید اتفاقاتی که در یک سیکل PCR می افتد را بررسی کنیم.

0:00:46.492,0:00:52.542
اولین مرحله در PCR، افزایش دمای واکنش

0:00:52.542,0:00:56.182
و ذوب کردن dna دورشته ای می باشد.

0:00:56.182,0:00:59.012
سپس وقتی که دما پایین امد،

0:00:59.012,0:01:06.412
پرایمرهای اختصاصی به توالی های انتهایی dna می چسبند.

0:01:06.919,0:01:12.739
حالا DNA جدید می تواند با فعالیت آنزیم پلیمراز

0:01:12.739,0:01:16.079
در جهت های مخالف ساخته شود.

0:01:16.079,0:01:20.999
در نتیجه دو کپی از DNA اولیه وجود خواهد داشت.

0:01:24.554,0:01:28.034
اگر این فرایند را متوجه نشدید

0:01:28.034,0:01:34.314
، ویدیوهای مربوط به PCRساده را یکبار دیگر مرور کنید.

0:01:35.788,0:01:39.748
برای شناسایی تولید محصولات جدید در RT PCR،

0:01:39.748,0:01:43.388
واکنش PCR نیاز به مواد دیگری نیز دارد:

0:01:44.244,0:01:47.514
یک پروب DNAتک رشته ای.

0:01:47.514,0:01:52.189
این پروب برای جفت شدن با بخشی از DNA طراحی شده است

0:01:52.189,0:01:55.354
که در بین دو پرایمر سنتز می شود.

0:01:55.421,0:01:59.176
به هرحال بر خلاف پرایمرها، این پروب با روش های اختصاصی

0:01:59.176,0:02:02.081
شناسایی می شود.و حساسیت شناسایی را بالا می برد

0:02:02.081,0:02:08.821
یکی از این نوکلئوتیدها با یک مولکول فلورسنت

0:02:08.821,0:02:16.541
و دیگری با مولکول QUENCHER یا خاموش کننده لیبل می شود.

0:02:16.636,0:02:20.786
مولکول خاموش کننده، به سرعت انرژی نورهای متساعدشده از

0:02:20.786,0:02:23.136
فلورسنت را جذب می کند.

0:02:23.136,0:02:26.706
البته تا زمانی که در فاصله نزدیکی از یکدیگر باقی بمانند.

0:02:30.385,0:02:38.465
حالا بیایید ببینیم وقتی این مواد در واکنش حضور دارند، چه اتفاقی می افتد.

0:02:40.039,0:02:44.039
پرایمرها به رشته های DNA جدا شده، می چسبد.

0:02:44.039,0:02:48.039
پروب هم به جایگاه مکمل بین پرایمرها متصل می شود.

0:02:49.576,0:02:54.966
انزیم، از دو انتهای پرایمرها، DNA جدید را می سازد.

0:02:54.966,0:02:59.926
هم چنین این انزیم یک فعالیت خارج هسته ای دیگر هم دارد:

0:03:00.904,0:03:04.904
این انزیم وقتی در مسیر خود به DNAدو رشته ای می رسد،

0:03:04.977,0:03:08.217
تمامی نوکلئوتیدهای DNA را جدا کرده

0:03:08.217,0:03:11.997
و ان ها دوباره جایگزین می کند.

0:03:12.930,0:03:16.220
زمانی که پلیمراز، از پروب عبور می کند،

0:03:16.220,0:03:24.690
نوکلئوتید دارای مارکر فلورسنت و خاموش کننده را از هم جدا می کند.

0:03:24.690,0:03:31.390
وقتی این دو مارکر جدا شدند، مولکول فلورسنت در صورت تحریک

0:03:31.390,0:03:34.738
میتواند نور قابل تشخیصی را تولید کند.

0:03:34.738,0:03:38.363
هر بار که رشته جدید از DNA ساخته می شود،

0:03:38.363,0:03:42.938
یک مولکول فلورسنت از خاموش کننده خود جدا می ماند.

0:03:43.060,0:03:48.860
بنابراین با دوبرابر شدن مقدار DNA در هر سیکل PCR،

0:03:48.860,0:03:53.760
مقدار انرژی تولیدی توسط فلورسنت نیز بالا می رود.

0:03:53.824,0:04:02.154
این انرژی زیاد توسط یک فلورمتر در داخل [br]دستگاه ترموسایکلر اندازه گیری می شود.

0:04:02.716,0:04:09.286
بنابراین اگر شما فرایند را با نمونه بالینی دارای یک کپی از DNA اغاز کنید،

0:04:09.342,0:04:12.782
به اندازه 40 سیکل PCR زمان می برد

0:04:12.782,0:04:16.862
تا این انرژی از طریق فلورمتر دستگاه، شناسایی شود.

0:04:17.227,0:04:24.372
اگر نمونه شما دارای بیش از 32 کپی از DNA باشد،

0:04:24.372,0:04:30.617
فرایند شناسایی در طی 5 سیکل کمتر اتفاق می افتد.

0:04:31.621,0:04:36.921
و اگر 1024 برابر بیشتر از نمونه خود را داشته باشید،

0:04:36.921,0:04:42.461
فلورسنت در طی 10 سیکل کمتر شناسایی خواهد شد.

0:04:43.168,0:04:50.493
بنابراین مقدار DNA موجود در نمونه،[br]با توجه به تعداد سیکل های PCR شناسایی خواهد شد.

0:04:50.493,0:04:57.063
زیرا مقدار فلورسنت نمونه به پایین ترین حد استانه تشخیص رسبده است

0:04:57.063,0:05:05.548
RT PCR معمولا برای شناسایی مقدار ویروس در خون بیماران HIV ،

0:05:05.548,0:05:10.483
هپاتیت B و دیگر ویروس ها به کار می رود

0:05:10.483,0:05:15.363
اما HIV یک ویروس دارای RNA است و DNA ندارد.

0:05:15.372,0:05:18.932
RNAتک رشته ای است.

0:05:18.932,0:05:24.072
بنابراین این فرایند چگونه انجام می شود؟

0:05:24.213,0:05:28.293
پاسخ این است: RNA بعد از کپی شدن

0:05:28.293,0:05:33.883
یا تبدیل شدن به DNA دو رشته ای اندازه گیری می شود.

0:05:33.901,0:05:37.901
این انیمیشن چگونگی این موضوع را نشان می دهد.

0:05:39.173,0:05:44.158
در ابتدا RNA ویروسی از ویروس ازاد میشود

0:05:44.158,0:05:53.963
سپس با استفاده از انزیم ریورس ترنس کریپتاز، از RNA ویروسی یک DNA مکمل ساخته می شود.

0:05:55.343,0:05:56.343
مشابه عمل ترجمه ی طبیعی که اتفاق می افتد

0:05:57.724,0:06:02.839
در بعضی از پروتوکل ها یک انزیم RNase اختصاصی هم اضافه می شود

0:06:02.839,0:06:07.034
تا RNA را بسازد و به ان اجازه می دهد تا تجزیه شود.

0:06:08.601,0:06:14.056
جدا از اینکه این مرحله اتفاق بیوفتد یا نه، مرحله کلیدی بعدی این است

0:06:14.056,0:06:23.531
که مشابه با واکنش PCR، DNAپلیمراز و پرایمر یک رشته DNA مکمل را می سازد.

0:06:23.541,0:06:30.376
در انتهای واکنش، RNA تک رشته ای ویروسی

0:06:30.376,0:06:37.212
به DNA دور شته ای تبدیل شده که همان نوکلئوتیدها را دارد.

0:06:37.318,0:06:43.321
حالا فرایند PCR می تواند برای این ,DNA همانند قبل انجام شود.

0:06:43.321,0:06:43.571
researchlabs@ مرجع دانلود ویدئو های آموزشی