(Spanish/Español translation by Dr. Gabriela Gorelik, University of Michigan and Juan Rodrigo Martin de Lucia) Este video muestra como un ácido nucleico específico se puede detectar y cuantificar en una muestra clínica
usando PCR.
Esto se logra mediante la detección de la acumulación de los productos amplificados por PCR, a medida que son
generados en la reacción.
Y así, el proceso se llama PCR en tiempo real o RT-PCR.
Para entender cómo los productos amplificados por PCR, también conocidos como amplicones, se detectan en tiempo real,
primero vamos a repasar los eventos que se producen durante un ciclo normal de la reacción de PCR.
Recordemos que el primer paso en cualquier ciclo de PCR es elevar la temperatura de reacción y fundir el
ADN de doble cadena.
Así, cuando la temperatura baja, los primers específicos se unen a las secuencias en
cada extremo del ADN en cuestión.
El ADN entonces se sintetiza por la reacción de la polimerasa en direcciones opuestas.
Así se producen dos copias del ADN de doble cadena , cuando se había empezado
con sólo una.
Si no le ha quedado claro este proceso básico, sería una buena idea revisar
el fundamento de PCR una vez más.
Para detectar la generación de amplicones nuevos en tiempo real, la reacción de PCR requiere un
ingrediente adicional: una sonda de ADN de simple cadena, diseñada para hibridizar
la secuencia de ADN sintetizada entre los dos primers.
Sin embargo, a diferencia de los primers, esta sonda es más definida en una manera especial. Uno de sus
nucleótidos está marcado covalentemente con una molécula fluorescente y otro nucleótido es marcado
con una molécula extinguidora de la fluorescencia.
La molécula extinguidora rápidamente absorbe energía de la luz emitida por la molécula fluorescente, siempre
y cuando se mantenga en estrecha proximidad.
Ahora, veamos lo que ocurre cuando este ingrediente adicional está presente durante un
único ciclo de PCR.
Otros primers se unen a las cadenas separadas de ADN.
La sonda también encuentra sus sitios complementarios entre ellos.
La enzima que sintetiza ADN nuevo a partir de los extremos de los primers también tiene una segunda actividad:
una actividad exonuclear.
Así, cuando se encuentra con ADN de doble cadena, desensambla la cadena
y sustituye todos los nucleótidos.
A medida que la polimerasa pasa a través de la sonda, los nucleótidos que llevan la marca fluorescente
se separan del extinguidor.
En ausencia de un extinguidor cercano, la molécula fluorescente puede emitir luz detectable cuando
es estimulada.
Cada vez que se produce otro amplicón, otro marcador fluorescente se libera de su vecino
extinguidor.
Por tanto, como el número de amplicones se duplica en cada ciclo de PCR, la cantidad emitida
de energía fluorescente también se duplica.
Esta generación de luz se puede monitorear durante la reacción de PCR con el fluorómetro que posee el termociclador.
Así, si se empieza con una muestra clínica que tenía sólo una copia del ADN, podría
tomar 40 ciclos o más antes de que los amplicones se detecten mediante un fluorómetro en un
termociclador especializado.
Sin embargo, si la muestra original contenía 32 veces más copias del ADN en cuestión, entonces
la detección fluorimétrica ocurriría en 5 ciclos menos de PCR.
Y si hubiera en la muestra original 1.024 secuencias más del ADN en cuestión, entonces la señal fluorescente
sería detectada 10 ciclos antes.
Así, la cantidad de ADN en cuestión en la muestra clínica es determinada en referencia al
ciclo de PCR en la que la curva de fluorescencia cruza el umbral de detección.
RT-PCR es muy comúnmente utilizado para cuantificar la carga viral en la sangre de pacientes
con el HIV, hepatitis B y otros virus.
Pero el VIH es un virus de ARN, no tiene ADN, y el ARN que posee es monocatenario.
Entonces, como funciona este método?
La respuesta es que el ARN del virus de ARN, se puede cuantificar después de que haya sido copiado
y convertido en ADN de doble cadena.
Este video muestra cómo se logra esto. En primer lugar, el ARN viral se libera del
virión.
Entonces, una cadena de ADN complementario se sintetiza a partir del ARN viral usando transcriptasa reversa purificada,
tal como lo hace en la replicación natural.
En algunos protocolos, una enzyma ARNasa especializada se agrega para formar el ARN y permitir
ser degradadas.
Si es o no parte del procedimiento, el siguiente paso clave se produce cuando una ADN polimerasa
y un primer generan una cadena de ADN complementario, tal como en la reacción de PCR.
Al final de esta reacción, el ARN viral de una sola cadena se ha convertido DNA de doble cadena
que tiene la misma secuencia de bases de nucleótidos.
La reacción de PCR cualitativa puede proceder como se describió previamente.