WEBVTT 00:00:02.031 --> 00:00:09.061 (Spanish/Español translation by Dr. Gabriela Gorelik, University of Michigan and Juan Rodrigo Martin de Lucia) Este video muestra como un ácido nucleico específico se puede detectar y cuantificar en una muestra clínica 00:00:09.061 --> 00:00:12.539 usando PCR. 00:00:12.539 --> 00:00:19.949 Esto se logra mediante la detección de la acumulación de los productos amplificados por PCR, a medida que son 00:00:19.949 --> 00:00:23.369 generados en la reacción. 00:00:23.369 --> 00:00:29.098 Y así, el proceso se llama PCR en tiempo real o RT-PCR. 00:00:29.098 --> 00:00:38.059 Para entender cómo los productos amplificados por PCR, también conocidos como amplicones, se detectan en tiempo real, 00:00:38.059 --> 00:00:46.047 primero vamos a repasar los eventos que se producen durante un ciclo normal de la reacción de PCR. 00:00:46.047 --> 00:00:53.036 Recordemos que el primer paso en cualquier ciclo de PCR es elevar la temperatura de reacción y fundir el 00:00:53.036 --> 00:00:55.094 ADN de doble cadena. 00:00:55.094 --> 00:01:03.007 Así, cuando la temperatura baja, los primers específicos se unen a las secuencias en 00:01:03.007 --> 00:01:06.084 cada extremo del ADN en cuestión. 00:01:06.084 --> 00:01:15.007 El ADN entonces se sintetiza por la reacción de la polimerasa en direcciones opuestas. 00:01:15.007 --> 00:01:21.729 Así se producen dos copias del ADN de doble cadena , cuando se había empezado 00:01:21.729 --> 00:01:23.028 con sólo una. 00:01:23.028 --> 00:01:30.229 Si no le ha quedado claro este proceso básico, sería una buena idea revisar 00:01:30.229 --> 00:01:35.499 el fundamento de PCR una vez más. 00:01:35.499 --> 00:01:41.067 Para detectar la generación de amplicones nuevos en tiempo real, la reacción de PCR requiere un 00:01:41.067 --> 00:01:50.017 ingrediente adicional: una sonda de ADN de simple cadena, diseñada para hibridizar 00:01:50.017 --> 00:01:54.329 la secuencia de ADN sintetizada entre los dos primers. 00:01:54.329 --> 00:02:02.529 Sin embargo, a diferencia de los primers, esta sonda es más definida en una manera especial. Uno de sus 00:02:02.529 --> 00:02:11.005 nucleótidos está marcado covalentemente con una molécula fluorescente y otro nucleótido es marcado 00:02:11.005 --> 00:02:16.004 con una molécula extinguidora de la fluorescencia. 00:02:16.004 --> 00:02:23.059 La molécula extinguidora rápidamente absorbe energía de la luz emitida por la molécula fluorescente, siempre 00:02:23.059 --> 00:02:27.459 y cuando se mantenga en estrecha proximidad. 00:02:27.459 --> 00:02:36.159 Ahora, veamos lo que ocurre cuando este ingrediente adicional está presente durante un 00:02:36.159 --> 00:02:39.769 único ciclo de PCR. 00:02:39.769 --> 00:02:44.099 Otros primers se unen a las cadenas separadas de ADN. 00:02:44.099 --> 00:02:49.029 La sonda también encuentra sus sitios complementarios entre ellos. 00:02:49.029 --> 00:02:56.629 La enzima que sintetiza ADN nuevo a partir de los extremos de los primers también tiene una segunda actividad: 00:02:56.629 --> 00:03:00.719 una actividad exonuclear. 00:03:00.719 --> 00:03:07.409 Así, cuando se encuentra con ADN de doble cadena, desensambla la cadena 00:03:07.409 --> 00:03:12.098 y sustituye todos los nucleótidos. 00:03:12.098 --> 00:03:18.379 A medida que la polimerasa pasa a través de la sonda, los nucleótidos que llevan la marca fluorescente 00:03:18.379 --> 00:03:24.078 se separan del extinguidor. 00:03:24.078 --> 00:03:32.299 En ausencia de un extinguidor cercano, la molécula fluorescente puede emitir luz detectable cuando 00:03:32.299 --> 00:03:34.098 es estimulada. 00:03:34.098 --> 00:03:41.098 Cada vez que se produce otro amplicón, otro marcador fluorescente se libera de su vecino 00:03:41.098 --> 00:03:43.017 extinguidor. 00:03:43.017 --> 00:03:50.299 Por tanto, como el número de amplicones se duplica en cada ciclo de PCR, la cantidad emitida 00:03:50.299 --> 00:03:52.959 de energía fluorescente también se duplica. 00:03:52.959 --> 00:04:00.059 Esta generación de luz se puede monitorear durante la reacción de PCR con el fluorómetro que posee el termociclador. 00:04:00.059 --> 00:04:02.012 00:04:02.012 --> 00:04:08.689 Así, si se empieza con una muestra clínica que tenía sólo una copia del ADN, podría 00:04:08.689 --> 00:04:15.048 tomar 40 ciclos o más antes de que los amplicones se detecten mediante un fluorómetro en un 00:04:15.048 --> 00:04:16.048 termociclador especializado. 00:04:16.048 --> 00:04:24.006 Sin embargo, si la muestra original contenía 32 veces más copias del ADN en cuestión, entonces 00:04:24.006 --> 00:04:30.069 la detección fluorimétrica ocurriría en 5 ciclos menos de PCR. 00:04:30.069 --> 00:04:38.003 Y si hubiera en la muestra original 1.024 secuencias más del ADN en cuestión, entonces la señal fluorescente 00:04:38.003 --> 00:04:42.139 sería detectada 10 ciclos antes. 00:04:42.139 --> 00:04:48.025 Así, la cantidad de ADN en cuestión en la muestra clínica es determinada en referencia al 00:04:48.025 --> 00:04:56.819 ciclo de PCR en la que la curva de fluorescencia cruza el umbral de detección. 00:04:56.819 --> 00:05:04.043 RT-PCR es muy comúnmente utilizado para cuantificar la carga viral en la sangre de pacientes 00:05:04.043 --> 00:05:08.449 con el HIV, hepatitis B y otros virus. 00:05:08.449 --> 00:05:19.289 Pero el VIH es un virus de ARN, no tiene ADN, y el ARN que posee es monocatenario. 00:05:19.289 --> 00:05:23.059 Entonces, como funciona este método? 00:05:23.059 --> 00:05:30.058 La respuesta es que el ARN del virus de ARN, se puede cuantificar después de que haya sido copiado 00:05:30.058 --> 00:05:34.005 y convertido en ADN de doble cadena. 00:05:34.005 --> 00:05:42.389 Este video muestra cómo se logra esto. En primer lugar, el ARN viral se libera del 00:05:42.389 --> 00:05:43.509 virión. 00:05:43.509 --> 00:05:51.096 Entonces, una cadena de ADN complementario se sintetiza a partir del ARN viral usando transcriptasa reversa purificada, 00:05:51.096 --> 00:05:56.021 tal como lo hace en la replicación natural. 00:05:56.021 --> 00:06:06.016 En algunos protocolos, una enzyma ARNasa especializada se agrega para formar el ARN y permitir 00:06:06.016 --> 00:06:08.005 ser degradadas. 00:06:08.005 --> 00:06:15.539 Si es o no parte del procedimiento, el siguiente paso clave se produce cuando una ADN polimerasa 00:06:15.539 --> 00:06:22.066 y un primer generan una cadena de ADN complementario, tal como en la reacción de PCR. 00:06:22.066 --> 00:06:31.669 Al final de esta reacción, el ARN viral de una sola cadena se ha convertido DNA de doble cadena 00:06:31.669 --> 00:06:37.024 que tiene la misma secuencia de bases de nucleótidos. 00:06:37.024 --> 00:06:42.610 La reacción de PCR cualitativa puede proceder como se describió previamente.